發(fā)布時間：2020-06-14 13:25

【摘要】：非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是一種無過量酒精攝入,而以肝實質(zhì)細胞脂肪變性和脂肪貯積為特征的臨床病理綜合征。其病理類型包括單純性脂肪肝、脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis,NASH)以及NASH相關(guān)肝硬化,后者可發(fā)展為肝癌。NAFLD常常與肥胖、2型糖尿病、高血壓、血脂紊亂等代謝綜合征(metabolic syndrome,MS)緊密相關(guān)。由于生活方式的轉(zhuǎn)變,飲食結(jié)構(gòu)中高脂肪的攝入等原因,NAFLD在全球分布廣泛,是臨床常見且高發(fā)的疾病,在我國的發(fā)病率也逐年迅速升高,是繼病毒性肝炎后第二位的常見肝病。NAFLD的自然病程尚未完全清楚,發(fā)病機制目前尚不能以單一的機制解釋。Day和James提出的“二次打擊”學(xué)說認為各種原因引起的肝細胞脂肪積聚和脂肪變性形成“初次打擊”,使肝細胞對炎癥反應(yīng)的各種損傷因素的易感性增高,而細胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化和氧化應(yīng)激、炎癥性細胞因子的釋放等因素形成“二次打擊”,誘導(dǎo)了肝臟炎癥反應(yīng)、肝細胞變性壞死和肝纖維化/肝硬化的發(fā)生。 脂代謝異常是NAFLD發(fā)生的基礎(chǔ)條件,各種細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的改變會造成不同的臨床轉(zhuǎn)歸。細胞功能障礙等病理情況下的應(yīng)激涉及線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細胞核等細胞器,它們既相對獨立又聯(lián)系緊密。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細胞折疊包裝蛋白并修飾轉(zhuǎn)運的主要場所,同時也是細胞的Ca~(2+)庫,對應(yīng)激極為敏感,在蛋白合成及其功能正確發(fā)揮、Ca~(2+)運輸、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中占據(jù)核心功能地位;線粒體是脂肪酸β氧化的主要區(qū)域,所有氧化還原反應(yīng)基本上都發(fā)生于此細胞器,它也是調(diào)節(jié)細胞代謝途徑,改變細胞生理的關(guān)鍵細胞器。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體結(jié)構(gòu)和功能上的聯(lián)系對維持細胞內(nèi)環(huán)境自穩(wěn)態(tài)具有重要意義。當(dāng)細胞出現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)部平衡狀態(tài)的打破稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ERS),發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激所激活的細胞內(nèi)信號通路的改變會對細胞造成生理的或者病理的改變,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)變化誘發(fā)線粒體功能的改變對決定細胞命運是至關(guān)重要的。近年來對于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路及其效應(yīng)在代謝綜合征中的研究十分廣泛,因此,我們認為做為一種代謝綜合征在肝臟中集中表現(xiàn)的NAFLD可能與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)存在重要聯(lián)系。所以,此次研究緊緊圍繞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及脂代謝在NAFLD中的角色和意義開展,以期為闡明其發(fā)病機制和為指導(dǎo)臨床 診療提供有價值的線索。主要的研究內(nèi)容和結(jié)果如下:研究內(nèi)容和方法: 正常培養(yǎng)的肝細胞L-02,采用油酸誘導(dǎo)其發(fā)生脂肪變性,制作NAFLD的細胞模型。采用油酸誘導(dǎo)0 h、24 h、48 h、72 h NAFLD模型組進行試驗分別模擬脂肪變不同程度模型。①油紅O染色觀察細胞脂肪變程度;②NAFLD細胞模型中定量RT-PCR檢測ERS激活的各條信號通路標(biāo)志物GRP78、ATF4、SREBP-1c mRNA的表達變化;③Western-Blot檢測GRP78、ATF4、SREBP-1c蛋白表達水平的變化;④構(gòu)建3個SREBP-1c真核表達干擾質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染L-02細胞,篩選高干擾效率質(zhì)粒;⑤在NAFLD細胞模型中轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒,沉默SREBP-1c的表達,檢測CCL2和FGF21基因mRNA的表達水平;⑥在NAFLD細胞模型中沉默SREBP-1c表達后,Western-Blot分析CCL2和FGF21蛋白表達的變化。 研究結(jié)果: 1.油酸誘導(dǎo)L-02肝細胞脂肪變性,通過油紅O染色觀察到脂肪變細胞橘色脂肪滴,細胞形態(tài)呈不規(guī)則多形態(tài),細胞內(nèi)脂肪滴的數(shù)量和大小與細胞油酸誘導(dǎo)培養(yǎng)時間長短和脂肪變程度保持一致。 2.細胞NAFLD模型中,定量分析ERS三條通路的標(biāo)志物GRP78、ATF4、SREBP-1c mRNA水平,結(jié)果顯示:油酸誘導(dǎo)24 h后,GRP78表達量迅速升高(P0.05);48 h時表達水平顯著升高(P0.01)并且高水平表達一直持續(xù)到72 h。ATF4在24 h后開始緩慢升高,但是在48 h后表達水平顯著上升,達到峰值后呈緩慢下降趨勢。SREBP-1c從24 h開始一直持續(xù)高水平表達。 3.細胞NAFLD模型中,ERS三條通路的標(biāo)志物GRP78、ATF4、SREBP-1c蛋白質(zhì)表達水平隨細胞脂肪變程度不同而各異。GRP78蛋白從肝細胞誘導(dǎo)脂肪變24 h開始,蛋白表達量明顯增加,并隨著時間延長維持在高表達水平。而ATF4蛋白表達水平迅速升高后有緩慢下降的趨勢。SREBP-1c蛋白的表達量開始時呈緩慢增加態(tài)勢,48 h后急劇增加,而72 h時則有所降低。 4.共設(shè)計了3條RNA干擾序列,構(gòu)建了3個相應(yīng)的RNA干擾真核表達質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染細胞L-02肝細胞,經(jīng)篩選得到一個高干擾效率的質(zhì)粒pSilencer-1.0-U6-4476。 5.在NAFLD細胞模型中轉(zhuǎn)染pSilencer-1.0-U6-4476質(zhì)粒沉默SREBP-1c基因表達后,定量分析CCL2基因和FGF21基因的mRNA表達,發(fā)現(xiàn)與NAFLD模型組相比, CCL2基因的mRNA水平在干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后24 h開始,表達水平顯著降低(P0.01)。而FGF21基因的mRNA表達在干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染24 h后,其變化趨勢跟CCL2基因基本一致,也呈明顯下調(diào)表達趨勢,此種差異也是極為顯著(P0.01)的。 6.在NAFLD細胞模型中沉默SREBP-1c基因的表達后,與NAFLD模型組相比,CCL2蛋白表達量明顯降低,72 h時基本檢測不到CCL2蛋白的表達,說明干擾SREBP-1c表達后,細胞脂肪變模型中炎癥變化減輕。同樣的實驗組設(shè)置中,FGF21蛋白表達水平顯著下降,說明干擾SREBP-1c表達后,細胞內(nèi)甘油三酯積累減少,脂肪變程度得到緩解。 結(jié)論: 1.油酸誘導(dǎo)L-02肝細胞發(fā)生脂肪變性,脂質(zhì)在細胞內(nèi)過度積聚,檢測分析發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)三條信號通路標(biāo)志物GRP78、ATF4、SREBP-1c mRNA和蛋白質(zhì)水平都呈現(xiàn)高表達態(tài)勢,說明在NAFLD細胞模型中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)生了應(yīng)激,提示ERS可能參與了NAFLD的形成和發(fā)展過程; 2.在NAFLD模型中ERS發(fā)生有不同時序性,不論從mRNA水平還是蛋白表達,GRP78可能是ERS變化的早期分子。而ATF4和SREBP-1c變化規(guī)律則不相同。 3.在NAFLD細胞模型中沉默SREBP-1c基因的表達,CCL2和FGF21基因的mRNA和蛋白質(zhì)表達水平均表現(xiàn)為低水平并逐漸下調(diào)表達,說明SREBP-1c下調(diào)表達可能緩解了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激所致的后續(xù)效應(yīng),改善了脂代謝的紊亂,從而引起細胞系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)減輕,改善了肝細胞生理狀態(tài),提示SREBP-1c可能成為臨床NAFLD治療的候選靶點。
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R575.5
【圖文】：

各基因溶解曲線圖

26圖 4 目的基因擴增曲線圖此次試驗將 0 h 組設(shè)置為對照組，得出不同程度非酒精性脂肪性病變肝細胞 GRP78、ATF4、SREBP-1c 相對對照樣本的含量比值。結(jié)果見表 1 和圖 5。 h 后，GRP78 表達量迅速升高（P<0.05）；48 h 時表達水平顯著升高（P<0水平表達一直持續(xù)到 72 h。ATF4 mRNA 表達水平在 24 h 后迅速升高，在上升達到峰值，跟對照組相比差異極顯著（P<0.01），72 h 時仍然高水平表降趨勢。SREBP-1c 從 24 h 開始表達水平升高，至 72 h 時表達水平在一個高于細胞內(nèi)固醇因內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)處于失代償狀態(tài)。

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本文編號：2712847