【摘要】： 第一章益生菌CMS-H002和CMS-H003菌株的特征分析 目的： 探討益生菌CMS-H002和CMS-H003菌株可能的藥用價值、遺傳穩(wěn)定性和抗生素敏感性。 方法： 1．益生菌CMS-H002和CMS-H003菌株的模擬胃腸環(huán)境的生存能力研究從湖南一泰公司種子庫中選擇菌株CMS-H002和CMS-H003，使用鹽酸，胃蛋白酶和牛膽汁模擬人類胃腸道環(huán)境，分別測定兩株益生菌對酸和膽汁的耐受能力。 2．益生菌CMS-H002和CMS-H003菌株的遺傳穩(wěn)定性分析確定了菌株CMS-H002和CMS-H003具有較好的耐酸耐耐膽汁能力后，通過測定其G+C摩爾百分含量，評價這兩株細(xì)菌的遺傳穩(wěn)定性。 3．益生菌CMS-H002和CMS-H003菌株的抗生素敏感性分析采用瓊脂紙片擴(kuò)散法分別測定菌株CMS-H002和CMS-H003對抗生素的敏感程度。 結(jié)果： 1．益生菌CMS-H002和CMS-H003菌株在PH值3.0和膽汁濃度0.5％的環(huán)境中培養(yǎng)4小時，細(xì)菌數(shù)(以吸光度表示)無明顯減少；在PH值為2.5-3.5和膽汁濃度為0-5g／l的梯度培養(yǎng)基中培養(yǎng)4小時，細(xì)菌數(shù)也無明顯減少；在人工胃腸環(huán)境中培養(yǎng)4小時，細(xì)菌數(shù)與培養(yǎng)前也無差異，分別是1×10~8和1×10~7。 2．益生菌CMS-H002和CMS-H003菌株經(jīng)過模擬胃腸生境后，其G+C摩爾百分含量分別是46.6％和47.2％，與初級鑒定的結(jié)果一致。 3．益生菌CMS-H002菌株在體外對羧芐青霉素、鏈霉素等33種抗生素敏感，對頭孢呋肟等9種抗生素不敏感。益生菌CMS-H003菌株在體外對氯霉素等18種抗生素敏感，對慶大霉素等24種抗生素不敏感。 結(jié)論： 菌株CMS-H002和CMS-H003對酸和膽汁有抗性，CMS-H002在體外對羧芐青霉素、鏈霉素等33種抗生素敏感，對頭孢呋肟等9種抗生素不敏感，G+C摩爾百分含量為46.6％。CMS-H003在體外對氯霉素等18種抗生素敏感，對慶大霉素等24種抗生素不敏感，G+C摩爾百分含量分別為47.2％。 第二章益生菌CMS-H002和CMS-H003菌株的藥效學(xué)研究 目的： 本部分實(shí)驗(yàn)主要進(jìn)行益生菌CMS-H002和CMS-H003治療UC的量效分析以及聯(lián)用益生菌治療UC的療效評價和部分作用機(jī)制探討。 方法： 1．UC模型的建立Balb／c小鼠自由飲用5％DSS(分子量5000)13天，建立改良右旋糖酐硫酸酯鈉(Dextran Sulfate Sodium，DSS)誘導(dǎo)的小鼠UC模型。 2益生菌治療UC的量效分析將Balb／c小鼠隨機(jī)分為正常對照組、模型組、生理鹽水組、巴柳氮組、CMS-H002高劑量組、CMS-H002中劑量組、CMS-H002低劑量組、CMS-H003高劑量組、CMS-H003中劑量組和CMS-H003低劑量組。正常對照組小鼠每日自由飲用消毒蒸餾水，其余各組小鼠每日自由飲用5％DSS，連續(xù)13天。制模同一天，正常對照組和模型組無任何處理；生理鹽水組每日給0.4ml生理鹽水灌胃；巴柳氮組按照每日8mg／10g體重灌胃；CMS-H002高、中和低劑量組每日分別按照4.0×10~9cfu，4.0×10~7cfu，4.0×10~5cfu／10g體重灌胃一次，CMS-H003高、中和低劑量組每日分別按照4.0×10~7cfu，4.0×10~5cfu，4.0×10~3cfu／10g體重灌胃一次。每日觀察小鼠的體重、糞便性狀及隱血。13天后處死各組小鼠，測量結(jié)腸長度，留取各組結(jié)腸標(biāo)本，行HE染色并觀察光鏡下結(jié)腸組織學(xué)病理變化。 3．聯(lián)合用藥的治療觀察將小鼠隨機(jī)分為正常對照組、模型組、生理鹽水組、巴柳氮組、CMS-H002組、CMS-H003組及聯(lián)合用藥組。制模方法同上。制模同一天，正常對照組和模型組無任何處理；生理鹽水組每日給0.4ml生理鹽水灌胃；巴柳氮組每日按照8mg／10g體重灌胃；CMS-H002組每日按照4×10~9cfu／10g體重灌胃一次；CMS-H003組每日按照4×10~7cfu／10g體重灌胃一次；聯(lián)合用藥組每日按照CMS-H0024×10~9cfu／10g體重和CMS-H003 4×10~7cfu／10g體重灌胃一次。每日觀察小鼠的體重、糞便性狀及隱血。于制模前一天和最后一天，分別留取每只小鼠糞便行菌群分析。13天后處死各組小鼠，測量結(jié)腸長度及重量，光鏡下觀察結(jié)腸組織學(xué)病理變化，電鏡下觀察結(jié)腸組織超微結(jié)構(gòu)的改變，生化測定結(jié)腸組織中髓過氧化物酶含量的變化。 結(jié)果： 1．益生菌治療UC的量效分析結(jié)果飲用5％DSS13天后小鼠結(jié)腸結(jié)腸長度由10.85縮短至8.65cm(P＜0.05)，DAI由0增至8.4。用益生菌CMS-H002和CMS-H003分別干擾飲用DSS的小鼠后，結(jié)腸長度與干擾劑量成正比，DAI與干擾劑量成反比。益生菌CMS-H002和CMS-H003的量越大其結(jié)腸長度和DAI越接近正常。低劑量組小鼠結(jié)腸長度和DAI變化趨勢接近于巴柳氮干預(yù)組，比鹽水干預(yù)組好(P＜0.05)。綜合分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，菌株CMS-H002和CMS-H003高劑量組對小鼠的一般情況、結(jié)腸病理變化的影響更優(yōu)于中劑量組。 2．聯(lián)合用藥的治療效果聯(lián)合用藥后，小鼠的一般情況、病理變化改善最為明顯。表現(xiàn)為兩菌合用組的結(jié)腸長度最長為9.98cm，結(jié)腸重量最輕為0.142g／g，DAI維持在最低水平為1.0-2.0，組織學(xué)評分最低為1.9，這也與光鏡下組織病理改變和電鏡下超微結(jié)構(gòu)改變一致。 3．初步機(jī)制探討結(jié)果 1)腸道菌群分析的結(jié)果顯示：UC小鼠腸道菌群發(fā)生了紊亂，表現(xiàn)為乳酸桿菌數(shù)量明顯減少(P＜0.01)，腸球菌和大腸桿菌數(shù)量不同程度增加(P＜0.01)，擬桿菌、雙歧桿菌和金葡菌菌數(shù)無明顯變化。給與益生菌治療后，以兩菌合用組腸道菌群構(gòu)成更接近正常菌群，表現(xiàn)為乳酸桿菌、丁酸梭菌和雙歧桿菌菌數(shù)明顯增加(P＜0.01)，而大腸桿菌和腸球菌菌數(shù)明顯減少(P＜0.01)，金葡菌和擬桿菌菌數(shù)無明顯變化。生理鹽水和巴柳氮對腸道菌群無影響。 2)腸組織MPO活力測定的結(jié)果顯示：飲用5％DSS13天的小鼠腸組織MPO的活力明顯增高。除生理鹽水組外，其它治療組均可明顯降低腸組織MPO的活力(P＜0.01)，以兩菌合用組MPO活力最低，與單用組比較有差異(P＜0.05)。 結(jié)論： 1．改良的DSS誘導(dǎo)UC動物模型不僅繼承了原制模方法準(zhǔn)確可靠、方法簡單、成本低、重復(fù)性好，短期內(nèi)出現(xiàn)明顯癥狀及結(jié)腸炎典型病理變化的特點(diǎn)，還具有死亡率低，適用于中重度UC模型研究的優(yōu)點(diǎn)。 2．口服益生菌CMS-H002和CMS-H003菌株具有治療DSS誘導(dǎo)的Balb／c小鼠急性UC的作用，療效隨劑量的增加而增強(qiáng)。兩菌聯(lián)合治療作用優(yōu)于單菌，優(yōu)于巴柳氮�？寡缀驼{(diào)節(jié)腸道菌群可能是它們發(fā)揮治療UC作用的部分機(jī)制。 第三章聯(lián)用益生菌CMS-H002和CMS-H003菌株治療UC的機(jī)制 目的： 本部分實(shí)驗(yàn)主要進(jìn)行聯(lián)用益生菌CMS-H002和CMS-H003菌株治療UC的機(jī)制研究。 方法： 將留取的各組結(jié)腸標(biāo)本，分別應(yīng)用免疫組化染色、酶聯(lián)免疫吸附法、免疫印記和半定量RT-PCR技術(shù)檢測小鼠結(jié)腸黏膜內(nèi)細(xì)胞因子EMAP-Ⅱ、TNF-a、IL-1β、IL-6、MCP-1、KC、P-selection、TF、PCNA和Caspase-1的表達(dá)。 結(jié)果： 1．飲用5％DSS13天的小鼠腸粘膜中EMAP-Ⅱ、TNF-a、IL-1β、IL-6、MCP-1、KC、P-selection、TF和Caspase-1表達(dá)明顯上調(diào)(P＜0.05)，PCNA明顯下調(diào)(P＜0.05)。 2．給予益生菌和巴柳氮干預(yù)后可明顯阻止腸粘膜EMAP-Ⅱ、TNF-a、IL-1β、IL-6、MCP-1、KC、P-selection、TF和Caspase-1的表達(dá)，同時促進(jìn)PCNA表達(dá)(P＜0.05)。 3．兩菌合用組阻止EMAP-Ⅱ、TNF-a、IL-1β、IL-6、P-selection、TF、PCNA和Caspase-1表達(dá)的作用優(yōu)于益生菌CMS-H002和CMS-H003菌株各單用組(P＜0.05)。 結(jié)論： 1．益生菌CMS-H002和CMS-H003菌株可能是通過減輕炎癥，抑制血栓，抑制凋亡和促進(jìn)增殖發(fā)揮其部分治療UC的作用。 2．EMAPⅡ參與了UC的發(fā)病過程，它可能是通過其自身促炎、趨化特性啟動炎癥，并上調(diào)其它促炎細(xì)胞因子、粘附因子、組織因子放大炎癥導(dǎo)致UC非特異性炎癥的組織學(xué)改變。益生菌CMS-H002和CMS-H003菌株可能通過下調(diào)它的表達(dá)發(fā)揮其部分治療作用。 3．兩菌合用組結(jié)腸粘膜中EMAP-Ⅱ、TNF-a、IL-1β、IL-6、P-sel、TF和Caspase-1的表達(dá)低于單用益生菌治療組，這可能是益生菌CMS-H002和CMS-H003菌株合用對UC發(fā)揮協(xié)同治療作用的分子機(jī)制。
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R574.62
【圖文】：

1.0:0.450:0.515。 2.2.3標(biāo)準(zhǔn)堿基和待樣品側(cè)定色譜圖圖1一10為標(biāo)準(zhǔn)堿基溶液反相高效液相色譜的分離結(jié)果，從色譜峰的高度、寬度和基線可以看出四種堿基完全分離，峰形良好，無雜質(zhì)峰，說明該條件完全符合G+c摩爾百分含量測定的要求，四種堿基出峰的時間:胞啥淀(C)為4.639min;鳥嚎吟(G)為10.073min;胸腺啥睫(T)為13.583;腺嚓吟(A)為17.18Omin。圖1一11、圖1一12為待測樣品的測定結(jié)果，因樣品DNA經(jīng)過酶的處理可見數(shù)個雜峰，但可與四種堿基完全分離，因而不會影響測定的結(jié)果。﨑圈.食n.竹口自24‘.勸口璐圖l一10標(biāo)準(zhǔn)堿基溶液分離圖語注:1、2、3、4分別代表C、G、T、A拍均勻.如，峰尖上的數(shù)字為出峰的時間.M偽認(rèn)偽t.N認(rèn)M.工寸.協(xié)寸卜0.州價.入?yún)f(xié)偽.寸拍釁巧50.SL一一且一一一一一一習(xí)， 3691215圖1一n菌株cMS一H002堿基溶液分離圖語 1821一i。注:1、2、3、4分別代表C、G、T、A

1.0:0.450:0.515。 2.2.3標(biāo)準(zhǔn)堿基和待樣品側(cè)定色譜圖圖1一10為標(biāo)準(zhǔn)堿基溶液反相高效液相色譜的分離結(jié)果，從色譜峰的高度、寬度和基線可以看出四種堿基完全分離，峰形良好，無雜質(zhì)峰，說明該條件完全符合G+c摩爾百分含量測定的要求，四種堿基出峰的時間:胞啥淀(C)為4.639min;鳥嚎吟(G)為10.073min;胸腺啥睫(T)為13.583;腺嚓吟(A)為17.18Omin。圖1一11、圖1一12為待測樣品的測定結(jié)果，因樣品DNA經(jīng)過酶的處理可見數(shù)個雜峰，但可與四種堿基完全分離，因而不會影響測定的結(jié)果。﨑圈.食n.竹口自24‘.勸口璐圖l一10標(biāo)準(zhǔn)堿基溶液分離圖語注:1、2、3、4分別代表C、G、T、A拍均勻.如，峰尖上的數(shù)字為出峰的時間.M偽認(rèn)偽t.N認(rèn)M.工寸.協(xié)寸卜0.州價.入?yún)f(xié)偽.寸拍釁巧50.SL一一且一一一一一一習(xí)， 3691215圖1一n菌株cMS一H002堿基溶液分離圖語 1821一i。注:1、2、3、4分別代表C、G、T、A

【參考文獻(xiàn)】

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1 崔海宏,陳村龍,王繼德,楊玉捷,崔耀升,王群英,賴卓勝;潰瘍性結(jié)腸炎患者腸粘膜中趨化因子和核轉(zhuǎn)錄因子的變化[J];第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;2003年10期

2 王群英,陳村龍,王繼德,馬強(qiáng),賴卓勝,張亞歷;潰瘍性結(jié)腸炎小鼠模型腸粘膜中細(xì)胞因子的表達(dá)和核轉(zhuǎn)錄因子κB的激活[J];第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;2003年11期

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本文編號：2712733