【摘要】：研究目的 探討慢性乙型肝炎肝組織內(nèi)和外周血單個(gè)核細(xì)胞內(nèi)雌激素受體α、雄激素受體mRNA含量與肝組織病理學(xué)狀態(tài)和肝組織HBsAg、HBcAg表達(dá)強(qiáng)度之間的相關(guān)性。 研究方法 1研究對(duì)象 1.1入選標(biāo)準(zhǔn)：參照2010年中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)制訂的《慢性乙型肝炎防治指南》中的診斷標(biāo)準(zhǔn),選取經(jīng)過(guò)肝穿刺活檢的慢性乙型肝炎患者162例,性別與年齡不限。 1.2排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝病、丙型肝炎、藥物性肝炎、自身免疫性肝病、膽汁淤積性肝病、淤血性肝病、肝豆?fàn)詈俗冃�、血色病及其他非乙肝病毒感染�?dǎo)致的肝��；(2)近半年內(nèi)曾經(jīng)使用激素替代藥物、或激素拮抗藥物、或抗肝纖維化藥物的患者；(3)肝硬化失代償期患者；(4)性腺疾病、內(nèi)分泌與其他可能影響體內(nèi)睪酮、雌二醇疾病的患者。 2標(biāo)本采集與保存 2.1肝穿組織標(biāo)本采集與保存：肝組織活檢采用1秒鐘經(jīng)皮肝穿刺法。肝組織標(biāo)本采集后分成兩段,長(zhǎng)度分別≥1.0cm和≥0.2cm,分別置入空塑料標(biāo)本管和預(yù)存RNA later的塑料標(biāo)本管內(nèi),立即冰凍送檢和放入-80℃凍存。 2.2外周血單個(gè)核細(xì)胞分離與保存：Ficoll密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞,離心后細(xì)胞沉淀加入少量的PBS,使細(xì)胞懸浮,再加入300μL的RNA later,-80℃冰箱凍存。 3實(shí)驗(yàn)方法 3.1肝組織病理狀態(tài)診斷：肝組織石蠟切片Masson染色和蘇木素-伊紅(hematoxylin and eosin, HE)染色,參照2000年西安全國(guó)病毒性肝炎及肝病學(xué)術(shù)會(huì)議修訂的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病理學(xué)分級(jí)(grading, G)和分期(staging, S)。 3.2肝組織HBsAg和HBcAg測(cè)定：肝組織石蠟切片HBsAg和HBcAg表達(dá)強(qiáng)度采用免疫組織化學(xué)法(immunohisto-chemistry,IHC)(二步法)測(cè)定。 3.3肝組織膠原纖維面積比測(cè)定：肝組織石蠟切片Masson染色,采用美國(guó)PE公司(PerkinElmer)的智能切片分析系統(tǒng)測(cè)定肝組織膠原纖維的面積比。 3.4肝組織內(nèi)和外周血單個(gè)核細(xì)胞內(nèi)雌激素受體α、雄激素受體mRNA含量測(cè)定：采用反轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)PCR測(cè)定。 4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS13.0軟件。肝組織內(nèi)和外周血單個(gè)核細(xì)胞內(nèi)雌激素受體α、雄激素受體mRNA含量與肝組織病理學(xué)狀態(tài)和肝組織HBsAg、HBcAg表達(dá)強(qiáng)度之間的相關(guān)性采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析,與肝組織膠原纖維面積比之間的相關(guān)性采用Pearson線性相關(guān)分析。肝組織內(nèi)和外周血單個(gè)核細(xì)胞內(nèi)雌激素受體α、雄激素受體mRNA含量在肝組織不同病理學(xué)分級(jí)、分期之間的差異采用單因素方差分析。性別、年齡、肝組織內(nèi)和外周血單個(gè)核細(xì)胞內(nèi)雌激素受體α、雄激素受體mRNA含量預(yù)測(cè)肝組織不同病理學(xué)分級(jí)、分期的效能評(píng)價(jià)分別采用Byes逐步判別分析。肝組織內(nèi)和外周血單個(gè)核細(xì)胞內(nèi)雌激素受體α、雄激素受體mRNA含量預(yù)測(cè)肝組織膠原纖維面積比的評(píng)價(jià)采用曲線估計(jì)。 結(jié)果 1肝組織內(nèi)和外周血單個(gè)核細(xì)胞內(nèi)雌激素受體α、雄激素受體mRNA含量與患者性別、年齡、肝組織病理分級(jí)和分期、肝組織膠原纖維面積比之間的相關(guān)性 肝組織內(nèi)雌激素受體α、雄激素受體mRNA含量與患者性別呈顯著負(fù)相關(guān)(rs=-0.250,P=0.001、rs=-0.206, P=0.008;注：男性賦值為1,女性賦值為0)；與患者年齡呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.298, P=0.000、r=-0.240, P=0.002);與肝組織病理學(xué)分級(jí)、分期之間呈顯著負(fù)相關(guān)(雌激素受體amRNA:rs=-0.484, P=0.000、rs=0.477,P=0.000；雄激素受體mRNA:rs=-0.591, P=0.000、rs=-0.523, P=0.000);與肝組織膠原纖維面積比呈顯著負(fù)相關(guān)(r=0.421, P=0.000、r=-0.299, P=0.002);與肝組織HBsAg表達(dá)強(qiáng)度無(wú)顯著相關(guān)性(rs=0.053, P=0.502、rs=0.081, P=0.053),與肝組織HBcAg表達(dá)強(qiáng)度分別無(wú)顯著相關(guān)性和和呈顯著正相關(guān)(rs=0.101,P=0.202、rs=0.170,P=0.031)。 外周血單個(gè)核細(xì)胞內(nèi)雌激素受體a、雄激素受體mRNA含量與患者性別無(wú)顯著相關(guān)性(rs=0.014,P=0.894、rs=-0.172,P=0.098；注：男性賦值為1,女性賦值為0)；與患者年齡無(wú)顯著相關(guān)性(r=-0.099,P=0.357、r=-0.032,P=0.771)；與肝組織病理學(xué)分級(jí)、分期之間分別無(wú)顯著相關(guān)性和呈顯著負(fù)相關(guān)(雌激素受體αmRNA:rs=-0.085,P=0.436和rs=-0.012,P=0.913；雄激素受體mRNA:rs=-0.243,P=0.023和rs=-0.326,P=0.002)；與肝組織膠原纖維面積比分別無(wú)顯著相關(guān)性和呈負(fù)相關(guān)(r=-0.051,P=0.702、r=-0.108,P=0.051)；與肝組織HBsAg表達(dá)強(qiáng)度無(wú)顯著相關(guān)性(rs=0.143,P=0.184、rs=0.199,P=0.063),與肝組織HBcAg表達(dá)強(qiáng)度分別無(wú)顯著相關(guān)性(rs=-0.169,P20.116、rs=-0.085,P=0.430)。 2肝組織內(nèi)和外周血單個(gè)核細(xì)胞內(nèi)雌激素受體α、雄激素受體mRNA含量在肝組織病理分級(jí)和分期、肝組織之間的差異 肝組織內(nèi)雌激素受體α、雄激素受體mRNA含量在不同病理學(xué)分級(jí)之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=30.056, P=0.000、F=45.819, P-0.000);在不同病理學(xué)分期之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=17.796, P=0.000、F=20.570, P=0.000)。 外周血單個(gè)核細(xì)胞內(nèi)雌激素受體α、雄激素受體mRNA含量在不同病理學(xué)分級(jí)之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.180, P=0.836、F=2.577, P=0.082);雌激素受體αmRNA含量在不同病理學(xué)分級(jí)之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.052,P=0.984),雄激素受體mRNA含量在不同病理學(xué)分期之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=3.434,P=0.021)。 3性別、年齡、肝組織內(nèi)和外周血單個(gè)核細(xì)胞內(nèi)雌激素受體α、雄激素受體含量預(yù)測(cè)肝組織不同病理學(xué)分級(jí)、分期的Byes逐步判別分析 以性別、年齡、肝組織內(nèi)和肝組織內(nèi)雌激素受體α、雄激素受體mRNA含量為自變量,肝組織病理學(xué)分級(jí)、分期為因變量,進(jìn)行Byes逐步判別分析。結(jié)果,只有雄激素受體mRNA符合模型自變量納入標(biāo)準(zhǔn),進(jìn)入判別模型�；谛奂に厥荏w的判別肝組織不同病理學(xué)分級(jí)的Fisher判別函數(shù)為：G1=-0.298+2.852×雄激素受體mRNA含量,G2=-1.208-0.098x雄激素受體mRNA含量,G3=-1.892-2.925x雄激素受體mRNA含量�；谛奂に厥荏w的判別肝組織不同病理學(xué)分級(jí)的Fisher判別函數(shù)判別G1、G2、G3的正確率分別為88.9%、12.2%、49.0%�；谛奂に厥荏w的判別肝組織不同病理學(xué)分期的Fisher判別函數(shù)為：S1=-1.413+3.148x雄激素受體mRNA含量,S2=-1.028+0.931×雄激素受體mRNA含量,S3=-2.542-2.215×雄激素受體mRNA含量,S4=-1.685-1.855×雄激素受體mRNA含量。基于雄激素受體的判別肝組織不同病理學(xué)分期的Fisher判別函數(shù)判別S1、S2、S3、S4的正確率分別為48.0%、59.5%、0%和28.9%。 以性別、年齡、肝組織內(nèi)和外周血單個(gè)核細(xì)胞內(nèi)雌激素受體a、雄激素受體mRNA含量為自變量,肝組織病理學(xué)分級(jí)、分期為因變量,進(jìn)行Byes逐步判別分析。結(jié)果,沒(méi)有一項(xiàng)指標(biāo)符合模型自變量納入標(biāo)準(zhǔn),進(jìn)入判別模型。 4肝組織內(nèi)和外周血單個(gè)核細(xì)胞內(nèi)雌激素受體a、雄激素受體mRNA含量預(yù)測(cè)肝組織膠原纖維面積比的曲線估計(jì) 以肝組織內(nèi)雌激素受體α、雄激素受體mRNA含量為自變量,肝組織膠原纖維面積比為因變量,進(jìn)行曲線擬合。結(jié)果,基于雌受體amRNA含量預(yù)測(cè)肝組織膠原纖維面積比的回歸模型的決定系數(shù)中,三次方模型的決定系數(shù)最大(R2=0.094)肝組織膠原纖維面積比=0.187-0.128x雌激素受體amRNA含量+0.081×雌激素受體αmRNA含量2+0.073×雌激素受體αmRNA含量3�；谛奂に厥荏wmRNA含量預(yù)測(cè)肝組織膠原纖維面積比的回歸模型的決定系數(shù)中,三次方模型的決定系數(shù)最大(R2=0.202)；肝組織膠原纖維面積比=0.311-2.692×雄激素受體mRNA含量+7.818×雄激素受體mRNA含量2-9.765x雄激素受體mRNA含量3。 以外周血單個(gè)核細(xì)胞內(nèi)雌激素受體a、雄激素受體mRNA含量為自變量,肝組織膠原纖維面積比為因變量,進(jìn)行曲線擬合。結(jié)果,基于雌激素受體α、雄激素受體nRNA含量預(yù)測(cè)肝組織膠原纖維面積比的回歸模型不成立。 結(jié)論 1肝組織內(nèi)雌激素受體a、雄激素受體表達(dá)水平與性別和年齡有關(guān),男性患者雌激素受體a、雄激素受體表達(dá)水平低于女性患者；青春期及青春期后,隨著年齡增長(zhǎng),肝組織內(nèi)雌激素受體α、雄激素受體表達(dá)水平逐步降低。肝組織內(nèi)雌激素受體α、雄激素受體表達(dá)可能參與慢性乙型肝炎發(fā)病和進(jìn)展,肝組織內(nèi)雌激素受體a、雄激素受體表達(dá)水平越低,肝組織炎癥活動(dòng)度和纖維化程度越高。肝組織內(nèi)雄激素受體可能促進(jìn)HBcAg表達(dá)。 2外周血單個(gè)核細(xì)胞內(nèi)雌激素受體α、雄激素受體表達(dá)水平與性別和年齡無(wú)關(guān)。外周血單個(gè)核細(xì)胞內(nèi)雄激素受體表達(dá)參與慢性乙型肝炎進(jìn)展,外周血單個(gè)核細(xì)胞內(nèi)雄激素受體表達(dá)水平越低,肝組織纖維化程度越高。外周血單個(gè)核細(xì)胞內(nèi)雄激素受體表達(dá)不影響肝組織內(nèi)HBcAg表達(dá)。 3肝組織內(nèi)和外周血單個(gè)核細(xì)胞內(nèi)雌激素受體α、雄激素受體表達(dá)水平不平行；其中青春期及青春期后,肝組織內(nèi)雌激素受體α、雄激素受體表達(dá)減少可能參與CHB發(fā)病和進(jìn)展。肝組織內(nèi)雌激素受體α、雄激素受體表達(dá)減少參與慢性乙型肝炎發(fā)病和進(jìn)展的機(jī)制不完全依賴于乙型肝炎病毒的復(fù)制和抗原表達(dá)。
【圖文】：

肝組織切片Masson染色肝纖維化病理分期40XSI：膠原纖維條帶形成；

Masson染色x100
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R512.62

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 許建民;陳建;王敏;劉福國(guó);;酒精對(duì)慢性乙型肝炎患者乙肝病毒多位點(diǎn)基因突變影響研究[J];山東大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2006年11期

2 王迎春;男性慢性乙型肝炎和乙肝后肝硬化患者血清性激素水平的變化[J];中國(guó)廠礦醫(yī)學(xué);2005年02期

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本文編號(hào)：2710517