【摘要】：第一部分乳清蛋白多肽MEIN對(duì)小鼠腫瘤抑制作用的研究 MEIN是一種具有抗炎功能的營(yíng)養(yǎng)機(jī)能食品,主要成分之一乳清蛋白含有a-乳清蛋白、β-乳球蛋白、血清白蛋白、免疫球蛋白、乳鐵蛋白等,其經(jīng)過(guò)堿化、超濾、凍干和胰酶分解后形成乳清蛋白多肽。MEIN的另一主要成分為乳酸菌酵解產(chǎn)物,包括用L.bulgaricus和S. thermophilus兩種乳酸桿菌發(fā)酵脫脂牛奶產(chǎn)生的低分子游離氨基酸、有機(jī)酸和短鏈脂肪酸,更有利于機(jī)體吸收。以往研究表明：乳清蛋白對(duì)腫瘤具有一定的抑制作用。本研究采用Lewis肺癌和C26結(jié)腸癌兩種常用的癌癥細(xì)胞株建立小鼠腫瘤模型,探討MEIN在體內(nèi)對(duì)腫瘤的抑制作用。 肺癌模型中將小鼠分為對(duì)照組和MEIN組,每組20只,雌雄各半,分別給予對(duì)照飼料AIN-93M和MEIN飼養(yǎng)16天,記錄肺癌荷瘤小鼠的進(jìn)食量、體重、腫瘤重量、腫瘤體積指標(biāo),并測(cè)定血清中MCP-1、IFN-γ、TNF、IL-12p70、IL-2、IL-4, IL-5、IL-6和IL-10炎癥因子水平。肺癌模型結(jié)果顯示,MEIN組與對(duì)照組小鼠體重、進(jìn)食量均無(wú)顯著性差異(P0.05); MEIN組小鼠的平均瘤重與對(duì)照組相比有顯著性降低(P0.05)；在腫瘤接種的第8天、第10天、第12天和第16天,MEIN組小鼠的平均瘤體積與對(duì)照組相比降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05); MEIN的瘤抑制率為51.52%。MEIN組血清中MCP-1和IL-6炎癥因子的濃度明顯低于對(duì)照組,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),肺癌模型研究提示：MEIN可能通過(guò)降低炎癥因子而抑制肺癌腫瘤的生長(zhǎng)。 結(jié)腸癌模型中將小鼠分為四組,每組24只,雌雄各半,分別給予對(duì)照飼料、MEIN、環(huán)磷酰胺(20mg/kg,隔天腹腔注射)、MEIN+環(huán)磷酰胺,連續(xù)16天。記錄結(jié)腸癌模型小鼠的進(jìn)食量、體重、腫瘤重量、肝臟、腎臟、脾臟和附睪脂肪重量；腫瘤接種一周后,隔天測(cè)腫瘤體積。結(jié)果顯示：四組小鼠的體重和進(jìn)食量無(wú)顯著性差異(P0.05)；MEIN+環(huán)磷酰胺組、環(huán)磷酰胺組的瘤重與對(duì)照組相比降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；MEIN+環(huán)磷酰胺組、環(huán)磷酰胺組小鼠的瘤體積與對(duì)照組相比,在第10天、第12天、第14天和第16天有顯著性降低(P0.05)；MEIN組小鼠與對(duì)照組相比,其瘤體積僅在第10天和第12天差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 結(jié)腸癌模型中,腫瘤組織病理學(xué)檢查提示：MEIN組、MEIN+環(huán)磷酰胺組和環(huán)磷酰胺組小鼠腫瘤浸潤(rùn)性等惡性程度較對(duì)照組低。MEIN組腫瘤組織中形成大量的凋亡細(xì)胞,未見(jiàn)明顯的細(xì)胞增殖。MEIN+環(huán)磷酰胺組可見(jiàn)散在的空泡細(xì)胞、凋亡細(xì)胞和凋亡小體。環(huán)磷酰胺組空泡細(xì)胞變性程度更嚴(yán)重,空泡細(xì)胞溶解,凋亡小體和凋亡細(xì)胞也較多,并出現(xiàn)核裂解現(xiàn)象。組織病理學(xué)發(fā)現(xiàn)對(duì)照組癌細(xì)胞分化程度較低；MEIN組、MEIN+環(huán)磷酰胺組、環(huán)磷酰胺組癌細(xì)胞分化程度較高。MEIN組、MEIN+環(huán)磷酰胺組和環(huán)磷酰胺組小鼠腫瘤浸潤(rùn)性等惡性程度較對(duì)照組低。 血清和腫瘤組織中MCP-1、IFN-γ、TNF、IL-12p70、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6和IL-10炎癥因子水平的檢測(cè)結(jié)果顯示,各組腫瘤組織和血清中炎癥因子水平與對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異(P0.05),但MEIN組IL-6和MCP-1水平低于對(duì)照組。 血常規(guī)檢查結(jié)果顯示：對(duì)照組的WBC明顯高于其他各組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),表明MEIN可能會(huì)降低荷瘤小鼠體內(nèi)的炎癥反應(yīng)。MEIN組RBC高于對(duì)照組,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),表明MEIN可能會(huì)改善荷瘤小鼠的營(yíng)養(yǎng)狀況。 采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測(cè)定血液中IgG、IgA、 IgG、C-反應(yīng)蛋白(CRP)和ALB的含量。測(cè)定結(jié)果：IgG和IgM在各組之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。對(duì)照組的CRP高于其他各組,且對(duì)照組的CRP與MEIN+環(huán)磷酰胺組比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),提示：MEIN可能會(huì)抑制機(jī)體的炎癥反應(yīng)。 采用免疫組化TUNEL檢測(cè)腫瘤切片細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示,對(duì)照組陽(yáng)性率為+／-,MEIN組和環(huán)磷酰胺組陽(yáng)性率為++,而MEIN+環(huán)磷酰胺組的凋亡率高于其他3組,其陽(yáng)性率為+++。提示,MEIN和環(huán)磷酰胺可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,且兩者具有協(xié)同作用。 免疫組化方法檢鋇Ki-67.VEGF與CD34在腫瘤組織中的表達(dá)。腫瘤組織中Ki-67檢測(cè)顯示,對(duì)照組和環(huán)磷酰胺組的染色陽(yáng)性率為++,MEIN組為+/-,MEIN+環(huán)磷酰胺組為+,結(jié)果提示,MEIN可以使腫瘤細(xì)胞處于靜息期,進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的繁殖生長(zhǎng)。該結(jié)果與病理HE染色結(jié)果相一致,在對(duì)照組腫瘤細(xì)胞增生活躍,而MEIN組和MEIN+環(huán)磷酰胺組以及環(huán)磷酰胺組腫瘤細(xì)胞的增殖現(xiàn)象不明顯。 腫瘤組織中VEGF檢測(cè)結(jié)果顯示,對(duì)照組陽(yáng)性率為+++,MEIN+環(huán)磷酰胺組和AIN-93M+環(huán)磷酰胺為+,而MEIN組中VEGF檢出量極低,為+/_。提示,在MEIN或是環(huán)磷酰胺的干預(yù)下,抑制了腫瘤組織中的新生血管的生成。 腫瘤組織中CD34檢測(cè)顯示,對(duì)照組陽(yáng)性率為+++,其他3組為+,結(jié)果提示：對(duì)照組中腫瘤組織血管生成活躍,而其他3組中雖然檢出CD34陽(yáng)性,但其比例遠(yuǎn)低于對(duì)照組,結(jié)果提示,在MEIN或是環(huán)磷酰胺的干預(yù)下,腫瘤組織中的新生血管生成受到了抑制。 本研究運(yùn)用小鼠肺癌和結(jié)腸癌兩個(gè)腫瘤模型研究MEIN的抗腫瘤作用,結(jié)果顯示,MEIN對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)具有一定的抑制作用,其作用機(jī)制可能通過(guò)抑制炎癥因子進(jìn)而抑制腫瘤的生長(zhǎng)。 第二部分尿激酶型纖溶酶原激活物缺失型小鼠肝纖維化研究 我國(guó)的肝纖維化和肝硬化的發(fā)病率很高,已成為我國(guó)一個(gè)重要的公共衛(wèi)生和社會(huì)問(wèn)題。采用uPA基因缺失(uPA-/-)小鼠構(gòu)建肝纖維化動(dòng)物模型,與野生型小鼠作為肝纖維化模型比較,其纖維化成功率高,是建立肝纖維化模型的易感品系。 本文通過(guò)研究uPA基因敲除小鼠(uPA-/-)的生物學(xué)特性、病理學(xué)較研究和a-平滑肌肌動(dòng)蛋白(a-SMA)與金屬基質(zhì)蛋白酶-13(MMPl3)的表達(dá),對(duì)uPA基因敲除小鼠(uPA-/-)肝纖維化模型的機(jī)制進(jìn)行研究并評(píng)價(jià)。 uPA基因敲除雜合子小鼠從美國(guó)Jackson Laboratory引進(jìn),經(jīng)過(guò)兩年育種培育成純合子小鼠,小鼠飼養(yǎng)于SPF屏障系統(tǒng)中。溫度控制22+1℃,相對(duì)濕度為50%-10%,明暗交替12h：12h。定期測(cè)定uPA-/-小鼠體重、血液生理生化值以及臟器(心、肝、脾、肺等)的重量,統(tǒng)計(jì)其繁殖特性,并對(duì)兩性的數(shù)值進(jìn)行比較。 選取成年雄性BL/6J野生型和uPA-/-基因缺失型小鼠,分為四組：對(duì)照組(WT,uPA-/-)和模型組(WT,uPA-/-),每組10只。模型組小鼠腹腔注射10%CC140.15ml,對(duì)照組小鼠腹腔注射橄欖油0.15ml,每周2次,連續(xù)6周。稱(chēng)取動(dòng)物體重和肝臟等臟器重量,計(jì)算臟器系數(shù)；取肝臟做大體病理觀察；用HE染色和Masson三色膠原染色觀察組織病理學(xué)改變；并進(jìn)行電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察；用real-time PCR方法檢測(cè)小鼠肝臟組織中a-SMA和MMP13的mRNA表達(dá),western blot及免疫組化分析a-SMA和MMP13的蛋白表達(dá)。 uPA基因敲除小鼠具的生物學(xué)特性研究顯示,4-30周齡uPA-/-小鼠體重性別間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),體重隨周齡增加而增長(zhǎng),前期增長(zhǎng)快,后期增重慢；uPA-/-小鼠繁殖性能平均產(chǎn)仔數(shù)為6.30+1.02只,平均妊娠期為20.5+1.9d,uPA-/-小鼠臟器重量的測(cè)定結(jié)果顯示心臟性別間差異顯著(P0.05)、脾的臟器重量性別間差異極顯著(P0.001),其余臟器重量性別間差異不顯著。8周齡uPA基因敲除小鼠血液生理指標(biāo)中紅細(xì)胞平均體積(MCV)、血小板平均體積(MPV)、紅細(xì)胞分布寬度-CV(RDW-CV)、嗜酸性粒細(xì)胞絕對(duì)值(E0)性別間有顯著性差異(P0.05)；血清生化指標(biāo)中uPA基因敲除小鼠性別之間谷丙轉(zhuǎn)氨酶ALT、血糖GLU、總膽固醇TC、膽堿脂酶CHE有顯著差異(P0.05),總蛋白TP、白蛋白ALB有極顯著差異(P0.001)。結(jié)論：uPA基因敲除小鼠具有自身的生物學(xué)特性。 uPA基因敲除小鼠病理學(xué)研究,與野生模型組小鼠相比,uPA-/-模型組小鼠的肝臟纖維化程度更加嚴(yán)重。表現(xiàn)為肝臟重量和肝臟系數(shù)的顯著增加(P0.05)；大體觀察肝臟腫大、色灰暗發(fā)白、出現(xiàn)顆粒狀結(jié)節(jié)；HE染色、Masson染色和電鏡超微結(jié)構(gòu)均提示uPA-/-模型組小鼠肝細(xì)胞破壞嚴(yán)重,膠原纖維沉積更廣泛,并形成了假小葉。 Real-timePCR結(jié)果顯示uPA-/-小鼠的肝臟中α-SMA.MMP13的mRNA表達(dá)量顯著高于WT小鼠；western blot結(jié)果顯示α-SMA蛋白在對(duì)照組小鼠肝臟中幾乎不表達(dá),在WT模型組中有少量表達(dá),在u.PA-/-模型組中表達(dá)明顯增多,MMP13蛋白在Mod-WT組肝臟組織中有少量表達(dá),在Mod-uPA-/-組中表達(dá)增多；免疫組化結(jié)果顯示,Mod-uPA-/-的a-SMA和MMP13表達(dá)高于Mod-WT。結(jié)果提示：uPA-/-模型組的肝臟纖維化程度比WT模型組嚴(yán)重,α-SMA的mRNA和蛋白表達(dá)在uPA-/-小鼠中均明顯升高,MMP13蛋白表達(dá)在肝纖維化模型小鼠中均有明顯升高�？赡艿臋C(jī)制為：uPA基因的缺失促進(jìn)了肝星型細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化,從而加速了細(xì)胞外基質(zhì)蛋白在肝臟中的沉積。 uPA基因敲除(uPA-/-)小鼠具有自身的生物學(xué)特性,部分指標(biāo)兩性間測(cè)定值有差異；uPA-/-小鼠是建立肝纖維化模型的易感品系,并且成功率高。從而uPA基因敲除(uPA-/-)小鼠肝纖維化模型的建立有助于闡明纖維化的發(fā)病機(jī)制,為新藥的篩選和藥效研究提供了優(yōu)良的模型,為臨床治療提供理論依據(jù)和切入點(diǎn)。
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類(lèi)號(hào)】：R575.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2709653