【摘要】： 第一章幽門螺桿菌cag A基因的克隆、原核表達(dá)及免疫活性研究 目的:克隆胃癌特異性幽門螺桿菌(Helicobacter pylori,H.pylori)的cagA基因片段,建立原核表達(dá)系統(tǒng),鑒定重組表達(dá)產(chǎn)物的免疫原性。為臨床胃癌相關(guān)H.pylori菌株篩選和針對(duì)性治療奠定基礎(chǔ)。 方法:選取前期研究確定的可能與胃癌相關(guān)的第6型菌株cagA基因片段,在GenBank中確定為AAG09884,優(yōu)化設(shè)計(jì)并合成cagA基因。并在該基因兩端分別添加內(nèi)切酶位點(diǎn),將合成的cagA基因從puc57-CagA質(zhì)粒中切出,用表達(dá)載體pET32a攜帶該基因轉(zhuǎn)化宿主菌BL21(DE3),通過氨卞青霉素抗性篩選和菌落PCR挑選出陽性克隆pET32a-cagA。以IPTG誘導(dǎo)含pET32a-CagA的宿主菌表達(dá)融合蛋白,經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳分析CagA蛋白表達(dá)情況,用Western-blot鑒定融合蛋白的抗原性。 結(jié)果:1.靶基因合成:設(shè)計(jì)并人工合成了cagA基因片段(AAG09884),該基因長(zhǎng)度為678bp,編碼228個(gè)氨基酸(圖1-1)。序列測(cè)定結(jié)果顯示,合成的cagA基因序列與設(shè)計(jì)的序列完全一致。2.成功構(gòu)建pET32a-CagA原核表達(dá)質(zhì)粒,其目的cagA基因的測(cè)序結(jié)果與設(shè)計(jì)的序列同源性為100%,對(duì)應(yīng)蛋白序列同源性100%。3.含pET32a-cagA的BL21(DE3)宿主菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后能表達(dá)出CagA融合蛋白,經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳分析結(jié)果表明,融合蛋白分子量大小與預(yù)期相一致(45KD)。4.Western-blot檢測(cè)結(jié)果顯示該融合蛋白可與抗H.pylori全菌抗體結(jié)合反應(yīng)。 結(jié)論:1.成功合成H.pylori菌株cagA基因片段,經(jīng)測(cè)序分析其氨基酸序列與GenBank上AAG09884的同源性達(dá)100%。2.成功構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a-cagA,經(jīng)IPGT誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化宿主菌,獲得分子量約45KD的CagA融合蛋白,且此蛋白具有CagA蛋白的抗原性。 第二章幽門螺桿菌cagA基因在胃上皮細(xì)胞中的表達(dá)及其對(duì)細(xì)胞凋亡的影響 目的:構(gòu)建含cagA基因的真核表達(dá)載體,并在胃上皮細(xì)胞GES-1中表達(dá),觀察其表達(dá)和定位情況及其對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。 方法:將合成的cagA基因片段從puc57-cagA質(zhì)粒中切出,分別克隆至綠色熒光蛋白表達(dá)載體pEGFP-C1及表達(dá)載體pCDNA3.1-his/myc-A,用脂質(zhì)體法分別將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入胃上皮細(xì)胞GES-1中,用熒光顯微鏡觀察其在GES-1細(xì)胞中的表達(dá)及定位,用熒光實(shí)時(shí)定量PCR及Western-blot檢測(cè)cagA基因在細(xì)胞中的表達(dá)情況。用流式細(xì)胞儀觀察CagA蛋白對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。 結(jié)果:1.成功構(gòu)建pEGFP-C1-cagA和pCDNA3-1-his/myc-A-cagA真核表達(dá)質(zhì)粒,目的基因的測(cè)序結(jié)果與設(shè)計(jì)的序列完全一致。2.綠色熒光蛋白表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-C1-cagA轉(zhuǎn)染GES-1后,其表達(dá)分布于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中。3.表達(dá)質(zhì)粒pCDNA3.1-his/myc-A-cagA轉(zhuǎn)染GES-1細(xì)胞后,cagA基因在細(xì)胞中獲得了表達(dá)。4.轉(zhuǎn)染pCDNA3.1-his/myc-A-cagA的GES-1細(xì)胞行流式細(xì)胞儀分析示CagA蛋白有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用。 結(jié)論:1.成功構(gòu)建幽門螺桿菌cagA基因的真核表達(dá)質(zhì)粒,并在胃上皮細(xì)胞株GES-1中獲得了表達(dá),且在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)均有表達(dá)。2.經(jīng)流式細(xì)胞儀分析,CagA蛋白具有促進(jìn)胃上皮細(xì)胞株GES-1凋亡的作用。
【圖文】：

1.2.3.3.1酶切:取兩個(gè)500pIEP管，一個(gè)加入pET一32a載體，一個(gè)cagA基因的重組質(zhì)粒，然后分別加入水、酶助月I，酶Xholl及其buf量如下:Plasmid6p1PET一32a2pl助刀1lplKPnllpl盤為0111pIJ扮0111pl10XHBuffer2pl10XBufferH2plddH2010p1ddHZO14pl總計(jì)20p1.總計(jì)20pl37℃水浴酶切過夜。1.2.3.3.2瓊脂糖凝膠電泳，回收:將酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，檢出現(xiàn)帶有。agA基因片段的帶(約700bp)和線狀pET一32a載體的帶(5.7

(2)封閉:轉(zhuǎn)印膜用PBS洗滌3次，每次約10min。將膜置于封閉液中，4℃過夜。靶蛋白與一抗的反應(yīng):次日將膜用PBS洗滌3次，每次1靦in。再置于用PBS稀釋的一抗(1:500)中，室溫微搖2h。靶蛋白與二抗的反應(yīng):取出膜用PBS洗滌3次，每次1枷in。再將膜置于用PBS稀釋的二抗(l:1000)中，室溫微搖lh后，用PBS洗滌3次，每次10min。(3)顯色:將膜置于NBT/BCIP顯色液中顯色，，待顯色充分時(shí)立即用去離子水洗滌并照相。3結(jié)果3.Ica護(hù)基因的優(yōu)化設(shè)計(jì)與合成結(jié)果設(shè)計(jì)并人工合成了cagA基因(從G09884)，該基因全長(zhǎng)為678bp，編碼228個(gè)氨基酸(圖l一2).序列測(cè)定結(jié)果顯示，合成的ca妞基因序列與設(shè)計(jì)的序列完全一致。
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R573

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2705872