【摘要】：研究背景及目的： 近年來,隨著經(jīng)濟(jì)水平的提高,生活方式的改變,非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)已成為我國(guó)導(dǎo)致慢性肝病的重要原因之一,其中,非酒精性單純性脂肪肝是一種良性病變,而非酒精性脂肪性肝炎則會(huì)進(jìn)展為肝纖維化、肝硬化甚至肝癌等終末期肝病。目前,NAFLD的發(fā)病機(jī)制尚不明確,已有一些研究表明,肝細(xì)胞凋亡是促進(jìn)其進(jìn)展的重要病理生理改變,且程度與疾病嚴(yán)重程度呈正相關(guān),但其中的機(jī)制仍未完全闡明。研究證實(shí),過度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激易導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙及細(xì)胞凋亡,而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的分子伴侶或許可以影響此過程。蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(protein disulfide isomerase, PDI)是一種定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)管腔的分子伴侶,在NAFLD中PDI是否可影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程,目前尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本研究旨在通過體外實(shí)驗(yàn)的方法,探索PDI在此過程中所起的作用,同時(shí)試圖闡明其可能的機(jī)制。 方法： (1)細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染：HL-7702細(xì)胞用加入了10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng),并置于含5%CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱中。傳代至狀態(tài)良好時(shí),消化后鋪至12孔板中,按LipofectamineTM 2000說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。72h后改用1mM FFA高脂培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h。 (2)油紅O染色：吸去培養(yǎng)基,用PBS輕柔漂洗后加入12%中性甲醛固定15min,然后用油紅稀釋液染色15min,60%異丙醇漂洗后用蘇木素復(fù)染5min,顯微鏡下觀察并拍照。 (3) Western Blot檢測(cè)：收集12孔板中的細(xì)胞并提取蛋白,將各組蛋白加入相應(yīng)泳道后進(jìn)行SDS-PAGE電泳,然后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上,封閉1 h,一抗4℃孵育過夜,再用二抗孵育后行ECL法檢測(cè),最后用凝膠成像系統(tǒng)拍照。 (4)細(xì)胞凋亡檢測(cè)：細(xì)胞用冷的PBS洗兩次并重懸后,加入適量的Annexin V和PI染色,混勻后避光孵育15min,孵育后加入1×buffer 400ul,用流式細(xì)胞儀完成檢測(cè)。 結(jié)果： (1)油紅O染色：與對(duì)照組相比,FFA脂變誘導(dǎo)組細(xì)胞胞漿內(nèi)可見大量紅染的脂滴,但經(jīng)高脂培養(yǎng)基誘導(dǎo)的三組,即單純FFA誘導(dǎo)組、PDI-negative siRNA+FFA誘導(dǎo)組及PDI-siRNA Mix+FFA誘導(dǎo)組組間差異不明顯。 (2)細(xì)胞凋亡結(jié)果：與對(duì)照組相比,單純FFA誘導(dǎo)組、PDI-negative siRNA+FFA誘導(dǎo)組、PDI-siRNA Mix+FFA誘導(dǎo)組的細(xì)胞凋亡比例依次升高。 (3)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及凋亡相關(guān)指標(biāo)：與對(duì)照組相比,GRP78在單純FFA誘導(dǎo)組、PDI-negative siRNA+FFA誘導(dǎo)組及PDI-siRNA Mix+FFA誘導(dǎo)組的表達(dá)均增高,并以PDI-siRNA Mix+FFA誘導(dǎo)組增高最明顯。而CHOP在對(duì)照組、單純FFA誘導(dǎo)組、PDI-negative siRNA+FFA誘導(dǎo)組及PDI-siRNA Mix+FFA誘導(dǎo)組的表達(dá)是依次增高的。另外,IRE1在各組表達(dá)情況無明顯差異。 結(jié)論： (1)PDI表達(dá)下調(diào)能加重內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激程度； (2)PDI表達(dá)下調(diào)能加重由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡； (3)在HL-7702細(xì)胞中,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能主要通過上調(diào)CHOP表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生； (4) PDI可能不影響細(xì)胞發(fā)生單純脂變的過程。
【圖文】：

3.1脂肪變細(xì)胞模型的構(gòu)建細(xì)胞貼壁后，除對(duì)照孔外，余孔改用lmMF隊(duì)高脂培養(yǎng)基分別培養(yǎng)24h、48h、72h，到相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)后用油紅O染色，并用倒置顯微鏡觀察、拍照(圖3.1)。對(duì)照組 24hFFA組 48hFFA組 72hFFA組圖3.1高脂培養(yǎng)基誘導(dǎo)的脂變細(xì)胞模型對(duì)照組:細(xì)胞邊緣清晰，胞漿豐富，核膜完整，核大，可見核分裂相，油紅O染色后僅見少量且較小的紅染的脂滴。F隊(duì)脂變誘導(dǎo)組:細(xì)胞變圓，核大，部分細(xì)胞核被擠到一側(cè)，呈印戒樣改變，，胞漿內(nèi)可見大量紅染的脂滴;隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，脂滴逐漸增大。因24h脂變誘導(dǎo)已有較明顯的效果，且有相應(yīng)文獻(xiàn)依據(jù)[9]，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)將脂

PDI一siRNA敲低效果檢測(cè)
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R575.5

【參考文獻(xiàn)】

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1 鐘英強(qiáng);魏菁;傅玉如;邵靜;梁倚文;林燕華;劉娟;朱兆華;;陽離子脂質(zhì)體Lipofectamine2000對(duì)人胰腺癌Capan-2細(xì)胞的毒性作用[J];南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2008年11期

本文編號(hào)：2702755