【摘要】：第一部分C57BL/6J-EGFP轉(zhuǎn)基因小鼠臍帶間充質(zhì)干細胞分離、培養(yǎng)及其熒光標(biāo)記的鑒定 目的 建立小鼠臍帶間充質(zhì)干細胞（UMSCs）的分離與體外培養(yǎng)、擴增的方法；證明從C57BL/6J-EGFP轉(zhuǎn)基因小鼠臍帶分離得到的UMSCs在體外可以穩(wěn)定表達增強型綠色熒光蛋白（EGFP），從而為移植細胞的體內(nèi)示蹤提供有利工具。 方法 取孕16天C57BL/6J-EGFP轉(zhuǎn)基因小鼠，采用膠原酶和胰酶兩步法分離出單個UMSCs，貼壁法進行培養(yǎng)、純化；觀察細胞形態(tài)特征及生長狀態(tài)；流式細胞儀測定其表面標(biāo)志；進行成脂、成骨誘導(dǎo)及鑒定；在熒光顯微鏡下觀察不同代細胞EGFP的表達，收集不同代的細胞鑒定EGFP基因及蛋白的表達。 結(jié)果 1.膠原酶和胰酶兩步法消化臍帶可獲得大量單個細胞，在體外可以穩(wěn)定的生長、擴增。2.倒置顯微鏡下觀察細胞呈長梭形，束狀密集平行或旋渦狀排列。3.流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，分離得到的細胞穩(wěn)定表達相關(guān)抗原標(biāo)記CD90和CD106，但不表達CD34和CD45。4.在體外誘導(dǎo)下，分離得到的細胞可向脂肪細胞、成骨細胞分化。5.熒光顯微鏡下可觀察到細胞內(nèi)強烈的綠色熒光表達。6.EGFP基因PCR結(jié)果表明各代細胞均穩(wěn)定表達EGFP基因；免疫細胞化學(xué)法顯示細胞胞漿內(nèi)EGFP的表達。 結(jié)論 成功的建立了小鼠臍帶間充質(zhì)干細胞（UMSCs）的分離與體外培養(yǎng)、擴增的方法；證明了從C57BL/6J-EGFP轉(zhuǎn)基因小鼠臍帶分離得到的UMSCs各代能穩(wěn)定表達增強型綠色熒光蛋白（EGFP）。 第二部分臍帶間充質(zhì)干細胞移植治療急性肝衰竭小鼠的療效觀察及移植細胞的體內(nèi)示蹤 目的 用D-氨基半乳糖聯(lián)合脂多糖建立小鼠急性肝衰竭模型；評價臍帶間充質(zhì)干細胞（UMSCs）移植治療急性肝衰竭的療效；觀察在體示蹤增強型綠色熒光蛋白(EGFP)基因標(biāo)記的UMSCs的可行性，以及標(biāo)記干細胞在模型動物體內(nèi)的動態(tài)分布。 方法 用D-氨基半乳糖聯(lián)合脂多糖腹腔注射的方法建立小鼠急性肝衰竭模型。建模6h后將模型隨機分為：UMSCs移植組、生理鹽水對照組，比較兩組小鼠治療前后一般情況，不同時間點肝功能恢復(fù)情況，肝臟病理改變情況結(jié)果。取不同時間點UMSCs移植組小鼠肺、肝組織做冰凍切片，，熒光顯微鏡下觀察EGFP熒光標(biāo)記細胞在肺、肝組織的遷移和分布規(guī)律。取不同時間點UMSCs移植組小鼠的肝臟組織，利用相對定量RT-PCR對綠色熒光蛋白基因進行檢測，從而對UMSCs量的變化進行分析。 結(jié)果 UMSCs移植組小鼠存活率（40%）顯著高于生理鹽水對照組（10%），肝臟功能及肝臟病理均有部分改善。移植后24h，肝臟損傷區(qū)未見標(biāo)記細胞，移植后3d，標(biāo)記的UMSCs開始遷移、聚集在損傷肝臟。相對定量RT-PCR顯示EGFP基因在肝臟內(nèi)3d時表達量是24h時的1.66倍，在1月時表達量是24h時的5.17倍。 結(jié)論 移植同種異體UMSCs對于急性肝衰竭小鼠具有明顯的治療作用。經(jīng)尾靜脈移植的EGFP熒光標(biāo)記的UMSCs能夠向受損的肝臟遷移并定植。
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R575.3

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本文編號：2702369