發(fā)布時(shí)間：2020-06-08 01:35

【摘要】：【背景及目的】 全球約有2億人感染血吸蟲，流行于亞、非、拉，中國屬重感染區(qū)之一，其中1億2千萬人有臨床癥狀，2千萬人發(fā)病[1,2]。目前在中國仍有多達(dá)5千萬人面臨日本血吸蟲感染的危險(xiǎn)[3]。作為危害人類健康的常見寄生蟲疾病，血吸蟲肝纖維化的發(fā)病機(jī)制和治療方面的研究仍是臨床基礎(chǔ)研究的重點(diǎn)之一。 血吸蟲病肝纖維化在引起機(jī)體致病的同時(shí)，機(jī)體也會(huì)對(duì)血吸蟲形成耐受機(jī)制，也因蟲體抗原偽裝逃避機(jī)體攻擊而得以長(zhǎng)期寄生。蟲卵沉積和肉芽腫反應(yīng)導(dǎo)致纖維組織在肝臟中的積累，尤其門脈周圍纖維化阻塞通往肝臟的血流，最終形成門靜脈高壓。門靜脈高壓癥(portal hypertension，PHT)是一種常見的臨床綜合征，可引起嚴(yán)重并發(fā)癥危及生命。內(nèi)皮素(endothelin, ET)，作為迄今發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的縮血管肽類物質(zhì)，它于1988由日本學(xué)者Yanagisawa等[4]從豬主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液中分離出來，分別有三種異構(gòu)肽：ET-1、ET-2、ET-3；其中，ET-1對(duì)血管平滑肌的作用最強(qiáng)。內(nèi)皮素受體(endothelin receptor，ETR)則分為ETAR和ETBR, ETAR與ET的親和力表現(xiàn)為：ET-1 ET-2ET-3, ETBR則與三種異構(gòu)肽親和力相同。眾所周知，ETR的表達(dá)數(shù)量及功能決定了ET的生物學(xué)效應(yīng)。動(dòng)物體內(nèi)許多組織都能同時(shí)表達(dá)ETAR和ETBR,但各組織的ETR比例卻各有不同；組織ETR的分布情況決定了ET在該組織的作用，ET與其受體之間也可能存在負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制；在PHT的不同階段，同一組織內(nèi)皮素受體的表達(dá)分布也不相同；有關(guān)ETR受體拮抗劑已經(jīng)為藥物治療提供了新的研究領(lǐng)域。 肝纖維化發(fā)生發(fā)展離不開肝星狀細(xì)胞（Hepatic stellate cells,HSCs）持續(xù)激活。HSCs在激活的過程中會(huì)表達(dá)細(xì)胞因子及其受體，如ET-1和ET-1A、B型受體、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（transforming growthfactor-β，TGF-β）和TGF-β I、II、III型受體、血小板衍生的生長(zhǎng)因子Plateletderived growth-factor，PDGF）和PDGF受體的α、β亞單位等等。低氧、年齡、活化狀態(tài)、分布密度等均可影響HSCs表面受體的表達(dá)。HSCs與內(nèi)皮素系統(tǒng)（Endothelin system，ETS）相互作用，其效應(yīng)在肝內(nèi)外血管阻力形成、門靜脈血流量變化及肝纖維化進(jìn)展中都起到關(guān)鍵作用[5,6]。 HSP47（heat shock protein47，HSP47）是機(jī)體受到應(yīng)激后合成增加的應(yīng)激蛋白，主要存在于肝星狀細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，參與膠原的折疊與分泌，影響肝纖維化的進(jìn)展[7]。HSP47在多種疾病纖維化病理過程中顯著上調(diào)，其參與膠原合成，其表達(dá)量影響纖維化進(jìn)展;抑制HSP47表達(dá)可抑制膠原合成及組織纖維化[8,9]。血吸蟲感染所引起的肝纖維化與ETR表達(dá)的關(guān)系，國內(nèi)外報(bào)道甚少；HSP47在肝纖維化病理過程中究竟如何調(diào)控，目前也有待進(jìn)一步深入研究；本研究旨在應(yīng)用HSP47-shRNA干預(yù)鼠血吸蟲肝纖維化，探索其對(duì)HSCs受體表達(dá)的影響，，尋找新的診斷指標(biāo)及治療靶點(diǎn)。 【方法】 利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)，將本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的HSP47-shRNA干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入小鼠成纖維細(xì)胞（NIH/3T3細(xì)胞），同時(shí)設(shè)立非相關(guān)對(duì)照組（Negative control-shRNA）。分別利用實(shí)時(shí)定量PCR和western-blot方法檢測(cè)NIH/3T3細(xì)胞HSP47mRNA及蛋白水平的表達(dá)；流式檢測(cè)轉(zhuǎn)染后NIH/3T3膜受體表達(dá)。上述同樣分組，將shRNA干擾質(zhì)粒經(jīng)尾靜脈高壓注射，自日本血吸蟲小鼠感染第9W開始干預(yù)至感染第14W，動(dòng)態(tài)檢測(cè)模型門靜脈壓力改變；實(shí)時(shí)定量PCR和western-blot檢測(cè)體內(nèi)干預(yù)HSP47效應(yīng)；流式檢測(cè)HSCs膜受體表達(dá)變化。 【結(jié)果】 Real-time PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后NIH/3T3細(xì)胞HSP47-mRNA表達(dá)，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染24h（圖2，A）干擾質(zhì)粒對(duì)HSP47-mRNA抑制相對(duì)表達(dá)量為（25.39±2.358）%、轉(zhuǎn)染48h（圖2，B）為（48.71±1.391）%，分別于同轉(zhuǎn)染時(shí)間非相關(guān)對(duì)照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p0.01）。同時(shí)檢測(cè)轉(zhuǎn)染48h HSP47蛋白表達(dá)，結(jié)果與HSP47-mRNA一致。同時(shí)利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后ET-B受體表達(dá)，轉(zhuǎn)染48h為（30.825±5.460）%，與轉(zhuǎn)染前（53.433±5.243）%有顯著差異（p0.05）。TGF-β受體、PDGF受體分別檢測(cè)，轉(zhuǎn)染前后均無顯著變化。 感染第9周，尾靜脈注射HSP47-shRNA至感染第14W， HSP47-mRNA相對(duì)表達(dá)量下調(diào)至（2.686±0.7114）,與對(duì)照組（6.001±0.4583）比較，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p0.01）。HSP47蛋白表達(dá)經(jīng)Western-blot檢測(cè)，與mRNA變化一致。ShRNA干預(yù)組HSCs ETAR與ETBR平均熒光強(qiáng)度（MFI）與感染組相比，均顯著變化（p0.05）。ETAR由感染組（8538±493.71）降至（4249±344.42），ETBR則由感染組（5052±212.93）降至干預(yù)組（3706±193.76）。 【結(jié)論】 本研究將針對(duì)小鼠HSP47的shRNA干擾質(zhì)粒，經(jīng)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均證明其在基因及蛋白質(zhì)水平能有效干擾HSP47的表達(dá)。體外實(shí)驗(yàn)沉默HSP47后，NIH/3T3表達(dá)ETBR升高；應(yīng)用干擾質(zhì)粒體內(nèi)干預(yù)血吸蟲肝纖維化小鼠，干預(yù)組門靜脈壓力及ETR顯著降低；同時(shí)分析HSP47-mRNA與血吸蟲肝纖維化進(jìn)展ETR呈正相關(guān)。故由此推測(cè)HSP47與HSCs及ETS之間可能存在反饋調(diào)節(jié)機(jī)制，使之對(duì)肝纖維化調(diào)節(jié)具有維穩(wěn)性。
【圖文】：

圖 1，B），感染后較感染前均顯著升高，在感染第 9 降，但感染第 4W、9W 及 14W HSP47-mRNA 均顯著高HSP47 蛋白表達(dá)經(jīng)過 Western-blot 檢測(cè)，與 HSP47-mRNAA

3. 日本血吸蟲肝纖維化模型肝組織 HSP47-mRNA 與門靜脈壓力的相關(guān)性分析將感染后第4W、9W、14W小鼠肝組織HSP-mRNA與其門靜脈壓力指標(biāo)行相關(guān)性分析（n＝12），采用correlation---linear方法，兩者呈正相關(guān)（圖3，r＝0.7495，p＝0.005）。圖3 小鼠肝組織HSP-mRNA與門靜脈壓力相關(guān)性分析D
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R575.2

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2702318