【摘要】：乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)是一類引起人類乙型病毒性肝炎的DNA病毒。目前,全世界大約有400萬人感染HBV病毒,HBV的感染最終會導(dǎo)致肝功能衰竭、肝硬化和原發(fā)性肝細(xì)胞癌。在HBV感染過程中,HBV病毒抗原,如HBsAg、HBcAg、HBeAg,均可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗原特異性T細(xì)胞免疫反應(yīng),包括多種具有特異性抗病毒效應(yīng)的輔助性T細(xì)胞和自然殺傷性T細(xì)胞,對于控制病毒的感染至關(guān)重要。然而,慢性乙型病毒性肝炎患者常表現(xiàn)為HBV特異性T細(xì)胞免疫反應(yīng)受損,從而導(dǎo)致病毒感染的持續(xù)和慢性化進(jìn)展。 最近,CD4+Th細(xì)胞家族新型成員——Th17細(xì)胞亞群的發(fā)現(xiàn),改寫了經(jīng)典的Thl/Th2細(xì)胞免疫模式。這類細(xì)胞主要以分泌IL-17 (IL-17A)、IL-17F、IL-21、IL-22等細(xì)胞因子為特征,其增殖、分化過程需要IL-6和TGF-β的參與,并且需要STAT3依賴性的轉(zhuǎn)錄因子RORyt、RORa的表達(dá)。Th17細(xì)胞免疫反應(yīng)在腫瘤免疫以及多種自身免疫性疾病的免疫發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用。在病毒感染性疾病方面,抗原特異性Th17細(xì)胞反應(yīng)已被證實(shí)參與HCV感染后病毒的清除過程,并且發(fā)現(xiàn)在慢性乙型病毒性肝炎患者外周血循環(huán)中檢測到的高表達(dá)的Th17細(xì)胞亞群與疾病的進(jìn)展及肝臟的炎癥損傷程度密切相關(guān)。盡管如此,在人類慢性乙型肝炎病情進(jìn)展過程中,宿主對病毒特異性Th17細(xì)胞免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)機(jī)制仍未明了。 本課題旨在研究Thl7細(xì)胞亞群在慢性乙型肝炎患者體內(nèi)的表達(dá)水平,以及與病情進(jìn)展和炎癥狀態(tài)的相關(guān)性；探析免疫抑制分子IL-10和免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對HBV抗原特異性Th17細(xì)胞的調(diào)控作用,揭示轉(zhuǎn)錄因子Foxp3和RORyt分子參與調(diào)控HBV抗原特異性Th17細(xì)胞分化的可能機(jī)制,這對于闡明HBV感染宿主對Th17細(xì)胞的免疫調(diào)控機(jī)制,尋求慢性HBV感染特異性免疫治療的新思路和新方法具有重要意義。 因此,本研究共分為三個部分。 第一部分慢性乙型肝炎患者外周血循環(huán)Th17細(xì)胞亞群的檢測及臨床研究 研究目的 研究慢性乙型肝炎患者外周血循環(huán)Th17細(xì)胞亞群在不同病情狀態(tài)下的差異表達(dá),并分析其與臨床炎癥損傷指標(biāo)的相關(guān)性,探討Th17細(xì)胞參與機(jī)體抗HBV感染免疫的臨床意義。 研究方法 采集40例慢性乙型肝炎中度(CHB, Mild),37例慢性乙型肝炎重度(CHB, Severe)以及36例健康對照者的外周血單個核細(xì)胞(PBMC),通過流式細(xì)胞染色技術(shù)分析PBMC中Thl7亞群細(xì)胞的表達(dá)頻率。ELISA方法檢測部分患者HBV血清標(biāo)記物和血清IL-10水平,同時進(jìn)行肝功能(ALT)檢測。 研究結(jié)果 1、慢性乙型肝炎重度患者外周血循環(huán)中Th17細(xì)胞亞群的百分比(2.42±0.66%)明顯高于慢性乙型肝炎中度患者(1.944±0.78%)及健康對照者(2.02±0.69%),且差異具有顯著性(P0.05) 2、慢性乙型肝炎患者及健康人外周血循環(huán)中可以檢測到分泌IL-17的CD8+T細(xì)胞亞群(Tcl7細(xì)胞),且慢性乙型肝炎重度患者(0.121±0.120%)外周血循環(huán)中Tc17細(xì)胞亞群百分比明顯高于健康對照者(0.079±0.065%),差異具有顯著性(P0.05)。 3、慢性乙型肝炎患者外周血循環(huán)Th17細(xì)胞亞群百分比與血清ALT水平成正相關(guān)性(r==0.394,P=0.000)。 4、慢性乙型肝炎患者血清IL-10水平與外周血循環(huán)Th17細(xì)胞亞群百分比成負(fù)相關(guān)性(r=-0.452,P0.01) 研究結(jié)論 1、與健康人相比,慢性乙型肝炎患者外周血循環(huán)Th17細(xì)胞亞群的表達(dá)水平明顯增高； 2、乙型肝炎病毒感染患者外周血循環(huán)中存在高表達(dá)、可分泌IL-17的CD8+T細(xì)胞亞群； 3、慢性乙型肝炎患者外周血循環(huán)中Thl7細(xì)胞亞群可能參與肝臟炎癥損傷中促炎的病理過程； 4、IL-10可能參與慢性乙型肝炎病毒感染機(jī)體外周血循環(huán)中Th17細(xì)胞的調(diào)節(jié)過程。 第二部分IL-10對慢性乙型肝炎患者HBcAg誘導(dǎo)的Th17細(xì)胞亞群免疫調(diào)控機(jī)制的研究 研究目的 Th17細(xì)胞已被證實(shí)在宿主抗病毒感染的免疫過程中發(fā)揮了重要作用,然而,在HBV感染過程中宿主對Th17細(xì)胞亞群功能的調(diào)控機(jī)制知之甚少。本實(shí)驗(yàn)通過研究IL-10對慢性乙型肝炎患者外周血循環(huán)中Th17細(xì)胞亞群的調(diào)節(jié)作用,探討IL-10參與調(diào)節(jié)HBV誘導(dǎo)的特異性Th17細(xì)胞免疫反應(yīng)的可能機(jī)制。 研究方法 采集慢性乙型肝炎患者外周血標(biāo)本分離PBMC,在rHBcAg體外誘導(dǎo)培養(yǎng)過程中,分別給予rIL～10和anti-IL-10抗體進(jìn)行干預(yù)后,流式細(xì)胞儀檢測培養(yǎng)細(xì)胞中Th1、Th17細(xì)胞亞群的百分比變化,同時利用流式微珠陣列法檢測培養(yǎng)上清中相關(guān)細(xì)胞因子(IL-10、IL-17A、IL-22、IL-23、IL-6、TGF-β)的分泌量,蛋白質(zhì)印記法檢測CD4+T細(xì)胞中RORyt分子的表達(dá)水平。 研究結(jié)果 1、慢性乙型肝炎PBMC中可以檢測到rHBcAg誘導(dǎo)的Th1、Th17細(xì)胞亞群百分比增加,而在健康人PBMC中沒有明顯改變； 2、rHBcAg可以誘導(dǎo)慢性乙型肝炎患者的PBMC分泌Th17型相關(guān)細(xì)胞因子IL-17A、IL-22、IL-23、IL-6、TGF-β和免疫抑制因子IL-10； 3、慢性乙型肝炎患者的PBMC在體外培養(yǎng)過程中,給予rIL-10干預(yù),可以抑制rHBcAg誘導(dǎo)IL-17A、IL-22、IL-23、IL-6的分泌,而對TGF-β的分泌量無影響。同時,rIL-10干預(yù)可以下調(diào)慢性乙型肝炎患者PBMC中rHBcAg誘導(dǎo)的Thl7細(xì)胞百分比; 4、Anti-IL-10抗體干預(yù)后可上調(diào)慢性乙型肝炎患者PBMC中Th1、Th17細(xì)胞百分比,同時,伴有Th17型相關(guān)細(xì)胞因子IL-17A、IL-22、IL-23、IL-6的分泌增加和CD4+T細(xì)胞中RORyt表達(dá)上調(diào),但并不影響培養(yǎng)細(xì)胞中TGF-P的分泌和CD4+CD25+T細(xì)胞表達(dá)Foxp3。 研究結(jié)論 1、在慢性乙型肝炎患者,HBcAg不僅誘導(dǎo)致炎性Th1、Th17型細(xì)胞免疫反應(yīng),同時刺激免疫抑制因子IL-10的分泌增加； 2、IL-10通過抑制IL-6的分泌以及下調(diào)CD4+T細(xì)胞上RORyt分子的表達(dá),發(fā)揮對HBcAg誘導(dǎo)的Th17細(xì)胞免疫反應(yīng)的抑制作用； 3、IL-10對HBcAg誘導(dǎo)的Thl7細(xì)胞免疫反應(yīng)的抑制作用與表達(dá)Foxp3的CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的參與無關(guān)。 第三部分CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對慢性乙型肝炎患者HBcAg誘導(dǎo)的Thl7細(xì)胞亞群免疫調(diào)控機(jī)制的研究 研究目的 Yh17細(xì)胞和CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是參與慢性HBV感染宿主體內(nèi)抗病毒感染的免疫過程中重要的效應(yīng)細(xì)胞。然而,HBV感染過程中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對Th17細(xì)胞亞群功能的調(diào)節(jié)作用尚未明確。本實(shí)驗(yàn)通過研究CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對慢性乙型肝炎患者外周血循環(huán)中Th17細(xì)胞亞群的調(diào)控現(xiàn)象,探討CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞參與調(diào)節(jié)HBV誘導(dǎo)的特異性Th17細(xì)胞免疫反應(yīng)的可能機(jī)制。 研究方法 采集16名慢性乙型肝炎患者和18名健康人外周血標(biāo)本分離PBMC,流式細(xì)胞儀檢測Th17細(xì)胞、CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞亞群的百分比,并進(jìn)行兩者相關(guān)性分析。利用CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分選技術(shù)去除PBMC中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞以及Foxp3 siRNA干擾技術(shù)抑制PBMC中Foxp3分子表達(dá)水平,觀察CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對HBcAg誘導(dǎo)的Th17細(xì)胞表達(dá)的調(diào)控現(xiàn)象。 研究結(jié)果 1、慢性乙型肝炎外周血循環(huán)Thl7和CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞百分比均高于健康人(CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞：8.2±4.29%vs.6.59±1.56%；P0.01；Th17細(xì)胞：1.4±0.59%vs.1.16±0.36%,P0.01 by the student T test)； 2、慢性乙型肝炎外周血循環(huán)中Thl7與CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)性(r=-0.590,P=0.026)； 3、去除慢型乙型肝炎患者PBMC中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞,可明顯增加rHBcAg誘導(dǎo)培養(yǎng)細(xì)胞中Th17細(xì)胞百分比,差異具有顯著性(3.71±0.53% vs. 6.13±0.52%, P=0.0057 by the student T test) 4、利用Foxp3 siRNA干擾技術(shù)抑制慢型乙型肝炎患者PBMC中Foxp3分子表達(dá)水平,培養(yǎng)細(xì)胞中rHBcAg誘導(dǎo)的Th17細(xì)胞百分比明顯增高,且差異具有顯著性。 研究結(jié)論 1、在慢性乙型肝炎患者外周血循環(huán)中,Thl7細(xì)胞亞群和CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞亞群表達(dá)均高于健康人,且兩者表達(dá)水平具有一定的負(fù)相關(guān)性。 2、在慢性HBV感染過程中,CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞可以抑制HBcAg誘導(dǎo)的Thl7細(xì)胞亞群的增殖、分化作用。 3、CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞高表達(dá)的Foxp3分子參與宿主對HBcAg誘導(dǎo)的Th17細(xì)胞亞群增殖、分化的抑制過程。 全文結(jié)論 1、慢性乙型肝炎患者外周血循環(huán)中Th17和CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞亞群表達(dá)水平明顯高于健康人,且兩者的高表達(dá)水平具有一定的相關(guān)性；高表達(dá)的Th17細(xì)胞亞群可能參與慢性乙型肝炎患者肝臟炎癥損傷的病理過程。 2、在慢性乙型肝炎患者,HBcAg不僅誘導(dǎo)致炎性Th1、Th17型細(xì)胞免疫反應(yīng),同時刺激免疫抑制因子IL-10的分泌增加；IL-10通過抑制IL-6的分泌,隨之下調(diào)CD4+T細(xì)胞上RORyt的表達(dá),發(fā)揮對HBcAg誘導(dǎo)的Th17細(xì)胞免疫反應(yīng)的抑制作用。 3、在慢性HBV感染過程中,CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞可以抑制HBcAg誘導(dǎo)的Th17細(xì)胞亞群的增殖、分化作用。CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞高表達(dá)的Foxp3分子參與宿主對HBcAg誘導(dǎo)的Th17細(xì)胞亞群增殖、分化的抑制過程。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R512.62

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本文編號：2702057