【摘要】：研究背景與目的 慢加急性肝衰竭(ACLF)是指在既往明確診斷或未診斷的慢性肝病基礎(chǔ)上,出現(xiàn)急性肝功能損害,表現(xiàn)為黃疸和凝血功能障礙,并且在4周內(nèi)出現(xiàn)腹水或/和肝性腦病。在我國(guó),90%以上ACLF病例存在HBV感染,被稱為乙型肝炎相關(guān)慢加急性肝衰竭(HB-ACLF)。 HB-ACLF患者病情重,治療費(fèi)用高,預(yù)后不良,3個(gè)月生存率只有62%,目前唯一有效的治療手段是肝移植。 目前認(rèn)為HB-ACLF的發(fā)病取決于病毒和宿主兩方面因素。一方面研究認(rèn)為,HBV基因組前C區(qū)(PC)和C基因啟動(dòng)子(BCP)核苷酸變異可能引起病毒復(fù)制和抗原表達(dá)水平的改變,可能與乙型肝炎相關(guān)肝衰竭的發(fā)生有關(guān)。另一方面,更多的研究集中在HB-ACLF發(fā)病時(shí)機(jī)體免疫狀況的改變,結(jié)果發(fā)現(xiàn)單核-巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、CD4+及CD8+T淋巴細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、Th17細(xì)胞以及多種細(xì)胞因子都可能參與HB-ACLF發(fā)生和發(fā)展過(guò)程。 白細(xì)胞介素-21(IL-21)是由激活的CD4+T細(xì)胞和NKT細(xì)胞分泌的一種Ⅰ類細(xì)胞因子,廣泛參與機(jī)體免疫活動(dòng)的調(diào)控作用,能夠影響多種免疫細(xì)胞的發(fā)育、活化、擴(kuò)增和功能表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)IL-21與炎性腸病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、Ⅰ型糖尿病、銀屑病和風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等多種炎癥性、自身免疫性或風(fēng)濕性疾病發(fā)病有關(guān)。而且越來(lái)越多的證據(jù)表明,IL-21參與機(jī)體的抗感染免疫,如人類免疫缺陷病毒感染時(shí),IL-21能夠促進(jìn)NK和CD8+T細(xì)胞存活、增強(qiáng)其細(xì)胞毒活性。最近,來(lái)自HBV轉(zhuǎn)基因鼠的研究發(fā)現(xiàn),IL-21的分泌具有年齡依賴性；然而,IL-21在HBV感染導(dǎo)致的肝臟炎癥活動(dòng),肝細(xì)胞損傷和病毒控制中的作用至今未明。 本研究通過(guò)檢測(cè)HB-ACLF、重度和輕度慢性乙型肝炎(S-CHB和M-CHB)患者以及健康對(duì)照(HC)血清IL-21及相關(guān)細(xì)胞因子水平,IL-21分泌細(xì)胞及相關(guān)CD4+T細(xì)胞亞群的頻數(shù),以及IL-21對(duì)其它炎癥因子分泌的影響,探索IL-21在HB-ACLF發(fā)病中的作用,并分析及其與疾病嚴(yán)重程度和預(yù)后的關(guān)系。 研究方法 第一部分：血清IL-21及相關(guān)細(xì)胞因子的檢測(cè) 本部分納入39例HB-ACLF、20例S-CHB、20例M-CHB患者和10例HC。HB-ACLF和S-CHB為2008年1月至2009年7月在南方醫(yī)院感染內(nèi)科和廣州市第八人民醫(yī)院住院患者。隨訪至2010年6月,HB-ACLF患者22例存活,16例死亡,1例接受原位肝移植；S-CHB患者全部存活。對(duì)其中7例入院后病情逐漸緩解的HB-ACLF患者進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察,這些患者入院只接受常規(guī)內(nèi)科對(duì)癥治療和核苷(酸)類似物(拉米夫定或恩替卡韋)抗HBV治療,均未接受糖皮質(zhì)激素和血漿置換術(shù)。 HB-ACLF的納入標(biāo)準(zhǔn)為：(1)血清HBsAg陽(yáng)性時(shí)間大于12個(gè)月；和(2)血清總膽紅素(TBIL)17、或每天上升17.1μmol/L;和(3)凝血酶原活動(dòng)度(PTA)40%；和(4)起病(出現(xiàn)黃疸和凝血功能障礙)后4周內(nèi)出現(xiàn)腹水或／和肝性腦病。 S-CHB的納入標(biāo)準(zhǔn)為：(1)血清HBsAg陽(yáng)性時(shí)間大于12個(gè)月；和(2)血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)600U/L;和(3)血清TBIL51.3μmol/L;和(4)PTA60%;但不足以診斷為HB-ACLF的患者。 M-CHB患者均為上述時(shí)間段南方醫(yī)院門診患者,納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)血清HBsAg陽(yáng)性時(shí)間大于12個(gè)月；和(2)血清ALT400U/L且80U/L:和(3)血清TBIL 51-3μmol/L。 健康對(duì)照10例,均為南方醫(yī)院感染內(nèi)科實(shí)驗(yàn)室學(xué)生或工作人員,納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)血清HBsAg陰性；和(2)血清ALT40U/L;和(3)血清TBIL17.1μmol/L。 所有研究對(duì)象均排除以下情況：(1)年齡60歲或18歲；或(2)合并感染人類免疫缺陷病毒(HIV)、甲型肝炎病毒(HAV)、丙型肝炎病毒(HCV)、丁型肝炎病毒(HDV)或戊型肝炎病毒(HEV)；或(3)合并甲狀腺功能亢進(jìn)、糖尿病等自身免疫性疾�。换�(4)合并惡性腫瘤；或(5)半年內(nèi)接受過(guò)干擾素、糖皮質(zhì)激素、或其它免疫調(diào)節(jié)制劑；或(6)影像學(xué)或組織學(xué)發(fā)現(xiàn)明顯肝硬化。 分離所有研究對(duì)象的血清-80℃貯存,采用流式微球試驗(yàn)(CBA)批量檢測(cè)血清中包括IL-21在內(nèi)的12種細(xì)胞因子的水平。 第二部分：外周IL-21分泌細(xì)胞的檢測(cè) 本部分納入21例HB-ACLF(存活14例,未存活7例)、13例S-CHB.19例M-CHB患者和10例HC,并對(duì)6例HB-ACLF恢復(fù)患者進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察。有8例S-CHB為新增病例,為同期南方醫(yī)院或廣州市第八人民醫(yī)院的住院患者；其余病例均來(lái)自第一部分試驗(yàn)。納入和排除標(biāo)準(zhǔn)如上述。密度梯度離心法分離患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC),采用細(xì)胞內(nèi)因子染色(ICS)的方法經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周IL-21分泌細(xì)胞及相關(guān)CD4+T細(xì)胞亞群的頻數(shù)。 第三部分：IL-21對(duì)PBMC分泌其它細(xì)胞因子的影響 選擇9例CHB患者和6例HC進(jìn)行IL-21的體外誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)。CHB的診斷標(biāo)準(zhǔn)參考2010年新版《慢性乙型肝炎防治指南》。分離研究對(duì)象的PBMC,以不同濃度(0、10和100ng/mL)的重組人IL-21(rhIL-21)蛋白刺激培養(yǎng)24小時(shí)后,收集培養(yǎng)上清,采用Bender FlowCytomix系統(tǒng)檢測(cè)11種細(xì)胞因子的濃度。 研究結(jié)果 第一部分：HB-ACLF患者血清II-21及相關(guān)細(xì)胞因子水平的變化。 不同人群血清IL-21及相關(guān)細(xì)胞因子濃度的比較。血清IL-21水平在HC. M-CHB. S-CHB和HB-ACLF依次升高,HB-ACLF患者顯著高于其它三組人群(P0.001,P0.001和P=0.001),且S-CHB患者顯著高于HC(P=0.042)。血清IL-6、IL-8、IL-10、IL-17A、IFN-γ和TNF-a水平在HB-ACLF亦有所升高,而IL-12/IL-23p40低于M-CHB,IL-1p、IL-2、IL-4和IL-12p70在四組人群間無(wú)顯著差異。 HB-ACLF存活與未存活患者血清IL-21及相關(guān)細(xì)胞因子的比較。未存活組血清IL-21(P=0.024)與IL-2(P=0.021)、IL-6(P=0.028)和IL-10(P=0.008)濃度顯著高于存活組患者。IL-12p70和IL-17A略高于存活組患者,但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.106和P=0.130)。其它細(xì)胞因子兩組間比較均無(wú)顯著差異。 HB-ACLF恢復(fù)患者血清IL-21及相關(guān)細(xì)胞因子的動(dòng)態(tài)變化。隨著病情緩解,血清IL-21(P=0.003)與IL-1β (P=0.050)、IL-8(P=0.004)、IL-12p70(P=0.018).和IFN-γ(P=0.015)水平均逐漸下降,前后比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；而IL-12/IL-23p40則逐漸升高,盡管統(tǒng)計(jì)學(xué)差異不顯著(P=0.104)。 血清IL-21及相關(guān)細(xì)胞因子水平與疾病嚴(yán)重程度的相關(guān)性。血清IL-21水平與MELD積分(r=0.573, P0.001)、TBIL (r=0.566, P0.001)、 PTA (r=-0.520, P0.001)、白蛋白(ALB, r=-0.369, P=0.001)、肌酐值(CR, r=0.327, P=0.012)顯著相關(guān),而與HBV DNA和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)無(wú)顯著相關(guān)性。其它細(xì)胞因子,與TBIL顯著相關(guān)的有IL-6、IL-8、IL-12p70、IL-17A、IL-12/12-23p40和IFN-γ;與MELD積分、PTA和ALB顯著相關(guān)的有IL-6、IL-8和IL-17A,與CR顯著相關(guān)的有IL-4、IL-10和IFN-γ。 血清細(xì)胞因子對(duì)HB-ACLF臨床結(jié)局的預(yù)測(cè)價(jià)值。以HB-ACLF患者兩種不同臨床結(jié)局(存活或未存活)為因變量,以12種細(xì)胞因子濃度為協(xié)變量進(jìn)行Logistic回歸分析,構(gòu)建診斷模型。有6種細(xì)胞因子進(jìn)入回歸方程,其中IL-21. IL-2、IL-10和TNF-α為HB-ACLF死亡患者的危險(xiǎn)因素,而IL-17A和IL-12/IL-23p40為保護(hù)因素。該模型對(duì)HB-ACLF患者臨床結(jié)局的正確判斷率為84.6%(33/39),低于MELD積分的正確判斷率97.4%(38/39)。進(jìn)一步對(duì)每種細(xì)胞因子構(gòu)建受試者工作特征曲線(ROC),并計(jì)算曲線下面積(A),只有IL-21(A=0.695,P=0.039)與IL-2(A=0.718,P=0.021)、IL-6(A=0.707,P=0.028)和IL-10(A=0.749, P=0.008)的診斷意義具有顯著性(P0.05),但其診斷效能仍低于MELD積分(A=0.953,P0.001)。 第二部分：HB-ACLF患者外周IL-21分泌細(xì)胞及相關(guān)CD4+T細(xì)胞亞群的頻數(shù)變化。 不同人群IL-21分泌細(xì)胞及CD4+T細(xì)胞亞群的頻數(shù)比較。四組人群分泌IL-21、IFN-γ、IL-10或IL-17A的總CD4+T細(xì)胞頻數(shù)整體比較均有顯著差異,IL-21+CD4+T細(xì)胞在HB-ACLF組最高,IFN-y+CD4+T細(xì)胞頻數(shù)在M-CHB組最高,而IL-10+CD4+T細(xì)胞和IL-17A+CD4+T細(xì)胞頗數(shù)存S-CHB織最高。名重比較發(fā)現(xiàn)：HB-ACLF和S-CHB患者的IL-21+CD4+T細(xì)胞頻數(shù)均顯著高于M-CHB患者(P0.001和P=0.002)和HC(P0.001和P=0.001),而HB-ACLF與S-CHB患者之間無(wú)顯著差異。M-CHB患者IFN-γ+CD4+T細(xì)胞頻數(shù)顯著高于S-CHB(P0.001)和HB-ACLF (P=0.004)患者,而與HC比較差異無(wú)顯著性。S-CHB和HB-ACLF患者IL-10+CD4+T細(xì)胞頻數(shù)顯著高于M-CHB患者(均P0.001)和HC(P=0.001和P=0.002),且S-CHB患者顯著高于HB-ACLF患者(P=0.028)。三組HBV感染患者之間的IL-17A+CD4+T細(xì)胞頻數(shù)相互比較無(wú)顯著差異,但均顯著高于HC (HB-ACLF, P=0.003; S-CHB, P=0.004; M-CHB, P=0.017)。 進(jìn)一步對(duì)IL-21+CD4+T細(xì)胞共表達(dá)IFN-γ、IL-10和IL-17A的情況進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)：EL-21+IFN-γ+、IL-21+IL-17A+、IL-21+IL-10+和IL-21+IFN-γ-IL-10IL-17A-的CD4+T細(xì)胞亞群在四組人群間整體比較均有顯著差異。除IL-21+IL-10+CD4+T細(xì)胞亞群的頻數(shù)在S-CHB最高外,另外三個(gè)IL21+CD4+T細(xì)胞亞群的頻數(shù)均以HB-ACLF患者最高。四組人群之間多重比較：HB-ACLF和S-CHB患者的IL-21+IFN-γ-IL-10IL-17A-CD4+T細(xì)胞亞群頻數(shù)顯著高于M-CHB患者(均P0.001)和HC(P0.001和P=0.001),而S-CHB與HB-ACLF無(wú)顯著差異。IL-21+IFN-γ+CD4+T細(xì)胞亞群頻數(shù)在HC、M-CHB、S-CHB和HB-ACLF患者遞增,HC顯著低于三組HBV感染患者(P=0.018,P=0.006和P0.001),且M-CHB患者顯著低于HB-ACLF患者(P=0.021),而S-CHB與HB-ACLF患者比較無(wú)顯著差異。S-CHB和HB-ACLF患者的IL-21+IL-10+CD4+T細(xì)胞亞群頻數(shù)顯著高于M-CHB患者(P0.001和P=0.001)和HC(P0.001和P=0.002),且S-CHB高于HB-ACLF患者(P=0.030)。HB-ACLF患者的IL-21+IL-17A+CD4+T細(xì)胞亞群頻數(shù)顯著高于M-CHB患者(P=0.004)和HC (P0.001), S-CHB患者亦高于HC(P=0.012),而其余各組間比較無(wú)差異。 HB-ACLF存活與未存活患者IL-21分泌細(xì)胞及CD4+T細(xì)胞亞群的比較。入院時(shí)存活與死亡患者外周分泌IL-21. IFN-γ. IL-10或IL-17A的CD4+T細(xì)胞頻數(shù)均無(wú)顯著差異。進(jìn)一步分析IL-21與IFN-γ、IL-10和IL-17A共表達(dá)的CD4+T細(xì)胞頻數(shù)在兩組間亦無(wú)顯著差異。 HB-ACLF恢復(fù)患者外周IL-21分泌細(xì)胞及CD4+T細(xì)胞亞群的動(dòng)態(tài)變化。6例恢復(fù)期HB-ACLF患者外周IL-21+CD4+T細(xì)胞頻數(shù)隨病情緩解而逐漸下降,前后變化具有顯著意義(P0.001)；而分泌IFN-γ、IL-10或IL-17A的CD4+T細(xì)胞亞群頻數(shù)在病程中的變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。進(jìn)一步對(duì)IL-21與IFN-γ、IL-10或IL-17A共表達(dá)CD4+T細(xì)胞亞群頻數(shù)的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)IL-21+IL-10+(P=0.007)和IL-21+IFN-γ-IL-10-IL-17A-(P0.001) CD4+T細(xì)胞頻數(shù)前后比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,均隨疾病恢復(fù)而下降；余無(wú)顯著差異。 外周IL-21分泌細(xì)胞及CD4+T細(xì)胞亞群與疾病嚴(yán)重程度的相關(guān)性。對(duì)進(jìn)行ICS檢測(cè)的53例處于不同疾病狀態(tài)(HB-ACLF. S-CHB或M-CHB)的HBV感染者的外周IL-21分泌細(xì)胞及CD4+T細(xì)胞亞群的頻數(shù)與反映疾病嚴(yán)重程度的臨床參數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析。IL-21CD4+T細(xì)胞頻數(shù)與MELD積分(r=0.605,P0.001)、TBIL (r=0.656, P0.001)、PTA (r=-0.322, P=0.019)和ALB (r=-0.587, P0.001)均顯著相關(guān),而與HBVDNA、ALT和CR的無(wú)顯著相關(guān)性。IFN-y+CD4+T細(xì)胞頻數(shù)與ALT、TBIL和MELD積分呈負(fù)相關(guān),而與ALB、CR和PTA呈正相關(guān)。IL-10+CD4+T細(xì)胞頻數(shù)與TBIL和MELD積分呈正相關(guān),而與ALB呈負(fù)相關(guān)。IL-17A+CD4+T細(xì)胞頻數(shù)與各臨床指標(biāo)均無(wú)顯著相關(guān)性。 對(duì)IL-21與IFN-γ、IL-10和IL-17A的共表達(dá)CD4+T細(xì)胞與疾病嚴(yán)重程度的相關(guān)性進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)：在排除上述三種共表達(dá)細(xì)胞的干擾后,IL-21+IFN-γ-IL-10-IL-17A-CD4+T細(xì)胞頻數(shù)與TBIL (r=0.733, P0.001)、MELD積分(1-0.649, P0.001)、ALB (r=-0.674, P0.001)和PTA (r=-0.377, P=0.005)的相關(guān)性更為顯著,相關(guān)系數(shù)更高。三種共表達(dá)細(xì)胞,IL-21+IFN-γ+CD4+T細(xì)胞頻數(shù)與MELD積分呈正相關(guān)；IL-21+IL-10+CD4+和IL-21+IL-17A+CD4+T細(xì)胞頻數(shù)與TBIL和MELD積分呈正相關(guān),而與ALB呈負(fù)相關(guān)；其余各指標(biāo)間無(wú)顯著相關(guān)性。 血清IL-21. IFN-γ、IL-10、IL-17A濃度與外周相應(yīng)因子分泌細(xì)胞頻數(shù)的相關(guān)性。共有55例研究對(duì)象同時(shí)接受了CBA檢測(cè)血清中IL-21、IFN-γ、IL-10、IL-17A蛋白濃度和ICS檢測(cè)外周分泌四種細(xì)胞因子的CD4+T細(xì)胞頻數(shù)。對(duì)兩種檢測(cè)的結(jié)果進(jìn)行Spearman相關(guān)性分析,發(fā)現(xiàn)只有血清IL-21濃度與IL21+CD4+T細(xì)胞頻數(shù)呈正相關(guān)(r=0.482, P0.001);IFN-y與IFN-y+CD4+T細(xì)胞(r=-0.067, P=0.627)、IL-10與IL-10+CD4+T細(xì)胞(r=0.114,P=0.406). IL-17A與IL-17A+CD4+T細(xì)胞(r=0.073,P=0.596)均無(wú)顯著相關(guān)性。說(shuō)明外周血中的IL-21主要由CD4+T細(xì)胞分泌,而IFN-γ、IL-10和IL-17A的來(lái)源則相對(duì)廣泛。 第三部分：IL-21對(duì)PBMC分泌其它細(xì)胞因子的影響。 血清IL-21水平與其它細(xì)胞因子濃度的相關(guān)性分析。對(duì)第一部分CBA檢測(cè)103份血清中各細(xì)胞因子的濃度進(jìn)行相關(guān)性分析,發(fā)現(xiàn)IL-21與IL-1p(r=0.252,P=0.010)、IL-2(r=0.426, P0.001)、IL-4(r=0.278, P=0.004)、IL-6(r=0.532, P0.001)、IL-8(r=0.2424, P0.001)、IL-10(r=0.207, P=0.036)、IL-12p70(r=0.451, P0.001)、IL-17A (r=0.330, P=0.001)、IFN-γ (r-0.362, P0.001)和TNF-α (r=0.303,P=0.002)均呈正相關(guān),但與IL-12/IL-23p40(r=-0.207, P=0.785)無(wú)顯著相關(guān)性。 IL-21體外對(duì)PBMC分泌其它細(xì)胞因子的影響。無(wú)論是對(duì)HC還是CHB患者的PBMC, rhIL-21均能顯著上調(diào)其IL-1p(P=0.009和P0.001)、IL-6(P=0.006和P0.001)、IL-10(P=0.002和P0.001)、IFN-γ(P=0.006和P=0.001)和TNF-α(均P=0.042)的表達(dá),并呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)。rhIL-21對(duì)IL-2和IL-12p70的分泌也有輕微促進(jìn)作用,而對(duì)IL-8則有輕微抑制作用,盡管兩者均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 結(jié)論與討論 相比于M-CHB和S-CHB患者,HB-ACLF患者血清IL-21水平顯著升高,且未存活患者高于存活患者,而隨著病情恢復(fù),血清IL-21水平又逐漸下降,說(shuō)明IL-21參與HB-ACLF的病理生理過(guò)程。血清IL-21水平與反映肝臟疾病嚴(yán)重程度的臨床指標(biāo)(如TBIL. PTA和MELD積分等)顯著相關(guān),并且對(duì)HB-ACLF的預(yù)后具有一定的判斷價(jià)值,提示血清IL-21有可能作為反映HB-ACLF肝臟疾病嚴(yán)重性和判斷預(yù)后的新的生物學(xué)指標(biāo)。 HB-ACLF和S-CHB患者外周IL-21分泌細(xì)胞的頻數(shù)顯著高于M-CHB和HC,隨病情恢復(fù)而逐漸減少,并且與反映肝臟疾病嚴(yán)重程度的臨床指標(biāo)相關(guān),進(jìn)一步說(shuō)明IL-21分泌細(xì)胞可能與肝臟嚴(yán)重的炎癥活動(dòng)有關(guān)。 體外rhIL-21能夠促進(jìn)IL-1β、IL-6、IL-10、IFN-γ和TNF-α的分泌,提示IL-21可能通過(guò)調(diào)節(jié)其它免疫細(xì)胞功能、上調(diào)前炎癥因子的表達(dá)的方式參與肝臟炎癥活動(dòng)。 上述證據(jù)表明,IL-21參與HB-ACLF的病理生理過(guò)程,血清IL-21水平有可能作為評(píng)估疾病嚴(yán)重性和判斷預(yù)后的良好指標(biāo),阻斷IL-21通路或許是早期干預(yù)HB-ACLF發(fā)生發(fā)展的一個(gè)新的治療靶點(diǎn)。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R512.62;R575.3

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