【摘要】：具有逆轉(zhuǎn)錄特征的生物酶廣泛存在于乙型肝炎病毒(HBV)、人類(lèi)T淋巴細(xì)胞病毒(HTLV)、鼠乳腺癌病毒(MMTV)、人類(lèi)自身免疫缺陷病毒(HIV)、花椰菜花葉病毒(CaMV)、勞氏肉瘤病毒(RSV)等多種動(dòng)植物病毒中，它們對(duì)人類(lèi)的自身健康和生產(chǎn)生活產(chǎn)生了巨大的不良影響。針對(duì)逆向轉(zhuǎn)錄酶 (RT)的藥物研究具有廣泛的重要意義。通常情況下，藥物研發(fā)過(guò)程必須要設(shè)計(jì)出適合于高通量篩選的靶位模型。傳統(tǒng)的RT活性的~3H摻入檢測(cè)法由于其操作過(guò)程復(fù)雜和放射性核素使用方面固有的缺陷，已不能滿(mǎn)足當(dāng)前的需要，而且難以發(fā)展成為高通量或半高通量的篩選技術(shù)。 我們?cè)趪?guó)內(nèi)首次構(gòu)建了RT活性的ELISA檢測(cè)法，應(yīng)用預(yù)先包被于Covalink 96孔板的poly(A)模板和不同來(lái)源的RT將生物素標(biāo)記的dUTP摻入，用辣根過(guò)氧化物酶反應(yīng)系統(tǒng)檢測(cè)酶活性，在一定時(shí)間范圍內(nèi)，反映酶活性的OD值的大小與時(shí)間呈線(xiàn)性關(guān)系。通過(guò)與放射性核素?fù)饺霗z測(cè)法進(jìn)行比較，顯示兩種方法有明顯的一致性(HIV-1 RT：r~2=0.997)。應(yīng)用ELISA法檢測(cè)奈韋拉平(NVP)、膦甲酸鈉(PFA)對(duì)HIV-1 RT活性的抑制作用，顯示出藥物作用的劑量依賴(lài)性，測(cè)得IC_(50)分別為0.23±0.12μg／ml、0.21±0.08μg／ml。同時(shí)，對(duì)ELISA法的重復(fù)性、穩(wěn)定性及用于抑制劑研究的特異性和敏感性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，證明了應(yīng)用ELISA法檢測(cè)HIV-1 RT的活性具有簡(jiǎn)便、快速、重復(fù)性好、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，適用于抗HIV-1 RT藥物的大樣品量篩選工作，，并可發(fā)展成為高通量技術(shù)。在成功構(gòu)建HIV-1 RT ELISA檢測(cè)方法的基礎(chǔ)上，利用該方法，進(jìn)一步檢測(cè)了莫洛尼鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(M-MLV-RT)、禽類(lèi)成髓細(xì)胞瘤病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(AMV-RT)及鴨乙型肝炎復(fù)制復(fù)合體(DHBV RCs)的活性，同時(shí)還檢測(cè)了HIV-1感染細(xì)胞上清中RT的活性，證明ELISA法適用于具有逆轉(zhuǎn)錄特征的多種病毒酶的體外活性檢測(cè)。 隨著高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法(HAART)在艾滋病患者中的廣泛應(yīng)用，抗HIV感染的聯(lián)合化療取得了極大成功，HIV的傳播得到了一定程度的控制，最新的研究表明，僅僅聯(lián)合使用兩個(gè)RT抑制劑如齊多夫定(AZT)和奈韋拉平(NVP)亦可使患者血液中HIV滴度降至檢測(cè)不到的水平。然而，HBV感染的治療卻面臨著相當(dāng)?shù)睦Ь常?) 與抗HIV RT的藥物相比，可供選擇抗HBV RT的治療藥物十分有限；2) 伴隨某種藥物的長(zhǎng)期單一應(yīng)用，耐藥病毒株不斷出現(xiàn)。尋找新的不同機(jī)制的抗HBV藥物，增加聯(lián)合用藥的候
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2005
【分類(lèi)號(hào)】：R512.62

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2694587