【摘要】： 背景:潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)是一種慢性非特異性結(jié)腸炎癥。近年來(lái),其發(fā)病率在世界范圍內(nèi)呈明顯上升趨勢(shì),發(fā)病人群多為青壯年,嚴(yán)重影響了患者生活質(zhì)量和社會(huì)生產(chǎn)力。UC的發(fā)病機(jī)制仍不清楚,缺乏有效的早期診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法和技術(shù)為潰瘍性結(jié)腸炎的早期診斷、防治和發(fā)病機(jī)制的研究提供了理論依據(jù)。 目的:應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)雙向凝膠電泳(Two-Dimensionalgel Electrophoresis,2-DE)和質(zhì)譜技術(shù)(Mass Speetrum,Ms)尋找并鑒定UC患者與健康對(duì)照者血清之間的差異表達(dá)蛋白質(zhì)。 方法: 1.以正常人血清樣品為研究對(duì)象,對(duì)白蛋白/IgG球蛋白去除后血清樣品、全血清進(jìn)行PH梯度2-DE分離,凝膠經(jīng)硝酸銀染色后,利用PDQuest軟件對(duì)2-DE圖譜進(jìn)行重復(fù)性分析,并對(duì)不同處理方法的血清2-DE圖像的結(jié)果進(jìn)行比較,以確定后續(xù)UC雙向凝膠電泳方法。 2.選擇潰瘍性結(jié)腸炎活動(dòng)期患者作為實(shí)驗(yàn)組;選擇健康志愿者作為正常對(duì)照組。運(yùn)用2-DE技術(shù)對(duì)其進(jìn)行血清蛋白質(zhì)差異表達(dá)分析。 3.結(jié)合軟件分析和手工篩選,從表達(dá)差異的蛋白質(zhì)點(diǎn)中選取12個(gè)清晰且表達(dá)水平改變明顯的點(diǎn)作為最終質(zhì)譜鑒定的對(duì)象;采用肽質(zhì)量指紋圖譜(PMF)的方法,并使用國(guó)際互聯(lián)網(wǎng)上的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)提供的檢索程序?qū)Σ町惖鞍踪|(zhì)進(jìn)行鑒定。 結(jié)果: 1.與全血清直接上樣比較,白蛋白/IgG球蛋白去除后血清樣品上樣蛋白丟失較少,凝膠硝酸銀染色顯示蛋白質(zhì)染色深、分散清楚。從而建立了白蛋白/IgG球蛋白去除后血清上樣進(jìn)行雙向電泳的方法,獲得分辨率較高且重復(fù)性好的人全血請(qǐng)蛋白質(zhì)2-DE圖譜,為分離高質(zhì)量的蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行UC血清蛋白組學(xué)研究奠定了良好的工作基礎(chǔ)。 2.比較UC和配對(duì)的正常組血清的2-DE圖譜,找出12個(gè)差異蛋白質(zhì)點(diǎn),結(jié)合基質(zhì)輔助激光解吸離子電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(Matrix assisted laser desorption/ionization-time of flight-mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)成功鑒定9個(gè)蛋白點(diǎn),其中6個(gè)表達(dá)上調(diào):觸珠蛋白、熱休克轉(zhuǎn)錄因子2、酪氨酸激酶受體、醛脫氫酶、載脂蛋白C-Ⅲ、中心粒旁物質(zhì)1;3個(gè)表達(dá)下調(diào):角蛋白1、細(xì)絲蛋白A結(jié)合蛋白1、肌球蛋白3。差異蛋白的功能主要涉及機(jī)體激素調(diào)節(jié)、免疫應(yīng)答、氧化應(yīng)激、信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞骨架等。 結(jié)論: 1.白蛋白/IgG球蛋白去除后血清樣品雙向凝膠電泳分析法具有蛋白丟失少、操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好的特性,是血清蛋白質(zhì)組學(xué)研究的有效手段。 2.采用蛋白質(zhì)組學(xué)2-DE和質(zhì)譜技術(shù),篩選并鑒定出了與潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)的9個(gè)血清蛋白質(zhì),為研究UC的生物學(xué)行為提供新的分子標(biāo)志物,為探討UC在蛋白質(zhì)水平的發(fā)生機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
【圖文】：

泳儀、二向電泳是在同一電泳槽中同時(shí)進(jìn)行的情況下。未去除白蛋白/IgG的血清蛋白2一DE凝膠圖譜(圖3)，由于大量白蛋白和IgG的存在，有很多平行條帶，掩蓋了一些低豐度蛋白質(zhì)點(diǎn)。而去除白蛋白/IgG的蛋白圖譜(圖4)與圖3比較，水平條帶明顯減少，蛋白質(zhì)斑點(diǎn)數(shù)量明顯增加。通過(guò)PDQuest7.1.o軟件包分析發(fā)現(xiàn)在未去除白蛋白/IgG的血清的雙向凝膠電泳圖譜中，檢測(cè)到約396個(gè)蛋白點(diǎn)，而在去除白蛋白/IgG的血清的雙向凝膠電泳圖譜中，檢測(cè)到約439個(gè)蛋白點(diǎn)。

圖9:spot3酶解后的膚質(zhì)量指紋圖譜自O(shè)翻自114側(cè)..匆月‘比.婦弓…協(xié)n.句no翻目1.人器黑翠日O協(xié)州牛栩吐門(mén)pl腸山叫.J.，困l協(xié)「司」心叭手川一令歇幣亡幽.口“.:’…翎.11二賀電妞扭拙妞兔傲電份飽傲摺飽也恤飽怡妞妞電〔;;…蓬撇.0‘悶由“小I，心卜4.‘.，.卜功解，J.曰.‘..‘，戶(hù)丫心，.U.!….丁以…〔丫〔丫.偽腸J」t.‘比，，，冬.弓…冬腸匕卜，’蒸理口之嶺:二習(xí)3幻蒸1、隊(duì)“皿‘.橄n蒸p奄晚目t丫啼比十hn公刁乳二‘心卜n月卜月‘勿卜n創(chuàng)1.]‘比卜一、n(二J】山比睜價(jià)n闊叮小心﨏閥哪助﨑、

本文編號(hào)：2694375