【摘要】：背景炎癥性腸病(inflammatory bowel diseases,IBD)是一組腸道非特異性炎癥疾病,包括潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)和克羅恩病(Crohn’s disease,CD)。目前,IBD的具體發(fā)病機(jī)制尚未明確,但是普遍認(rèn)為IBD發(fā)病是由多種因素相互作用共同導(dǎo)致,其中遺傳易感者在環(huán)境的刺激下,引起的腸道內(nèi)菌群失調(diào),腸道內(nèi)固有免疫和適應(yīng)性免疫紊亂,從而最終引起腸黏膜損傷。在我國,IBD的發(fā)病率和患病率近年來一直呈上升態(tài)勢,相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道和病例數(shù)目也逐漸增多。自噬(autophagy)是一種維持細(xì)胞正�；顒拥陌麅�(nèi)吞噬現(xiàn)象。組織細(xì)胞通過吞噬自身細(xì)胞質(zhì)蛋白,以及受損細(xì)胞器等內(nèi)容物,并最終在溶酶體中分解成為氨基酸、核糖等代謝物,從而維持實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的正常代謝以及穩(wěn)態(tài)。目前已經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)的自噬方式共有三種:大自噬(macroautophagy),小自噬(microautophagy),分子伴侶介導(dǎo)的自噬(chaperone-mediated autophagy,CMA)。CMA僅存在哺乳動物細(xì)胞內(nèi),具有一定的選擇性,主要是通過熱休克蛋白70識別含有KFERQ序列的蛋白后形成復(fù)合體定位到溶酶體,通過溶酶體相關(guān)膜蛋白2A(lysosome-associated membrane protein2A,LAMP2A)轉(zhuǎn)運(yùn)穿過溶酶體,最終被胞內(nèi)水解。LAMP2A作為CMA的限速分子,其表達(dá)或功能異常必定會影響疾病的發(fā)生、發(fā)展。在大量關(guān)于自噬和免疫的研究中,發(fā)現(xiàn)自噬不僅參與了大量固有免疫而且也參與了適應(yīng)性免疫應(yīng)答,而IBD發(fā)病的一個(gè)重要環(huán)節(jié)就是腸道內(nèi)固有免疫和適應(yīng)性免疫的紊亂,因此通過調(diào)節(jié)LAMP2A的表達(dá)從而影響CMA功能,是研究IBD的一個(gè)全新突破口。此外,IBD患者腸道粘膜的病變是由腸道微生態(tài)的失衡而引起的免疫紊亂所致。腸道正常的功能依賴于腸道微生物、腸上皮細(xì)胞和腸道免疫細(xì)胞三者之間的功能協(xié)調(diào)以及動態(tài)平衡。因此,對于攜帶IBD易感基因的個(gè)體來說,腸道內(nèi)異常微生物的定植可能是IBD發(fā)病的根源,這也為我們研究IBD的發(fā)病機(jī)制以及潛在治療方式提供了新的思路。方法1.利用Cre/lox P系統(tǒng)構(gòu)建了腸道上皮特異性LAMP2A過表達(dá)(specific intestinal epithelial cell-Lamp2a knock-in,LAMP2A-IECKI)小鼠。2.利用口服4%DSS溶液構(gòu)建小鼠結(jié)腸炎模型,并監(jiān)測造模過程中LAMP2A-IECKI小鼠及其野生型(wild-type,WT)每天體重,糞便隱血以及小鼠活動度。3.在造模第10天處死小鼠,完整取出小鼠結(jié)腸并測量長度。通過蘇木精-伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining,HE)和透射電鏡(transmission electron microscope,TEM)評價(jià)造模前后小鼠腸道結(jié)構(gòu)的改變,并通過免疫組化來評價(jià)腸上皮細(xì)胞LAMP2A過表達(dá)后腸道內(nèi)炎癥浸潤情況。4.通過小鼠糞便16S rDNA高通量測序分析LAMP2A-IECKI和WT小鼠腸道微生態(tài),從而評價(jià)經(jīng)LAMP2A腸上皮細(xì)胞過表達(dá)后對腸道菌群的影響。結(jié)果1.成功建立LAMP2A-IECKI小鼠模型。2.腸上皮細(xì)胞LAMP2A過表達(dá)后增加小鼠對于DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎的敏感性:在口服DSS造模過程中,LAMP2A-IECKI組小鼠體重下降明顯,糞便潛血嚴(yán)重,小鼠活動度降低;造模結(jié)束后,對比小鼠結(jié)腸長度發(fā)現(xiàn),LAMP2A-IECKI小鼠結(jié)腸長度明顯縮短,腸壁增厚變硬。3.腸上皮細(xì)胞LAMP2A過表達(dá)后可能通過增強(qiáng)CMA加重炎癥反應(yīng):DSS造模后,LAMP2A-IECKI小鼠結(jié)腸上皮微絨毛結(jié)構(gòu)排列紊亂,上皮細(xì)胞內(nèi)溶酶體增多,提示CMA顯著增強(qiáng);炎性細(xì)胞浸潤更明顯,其中巨噬細(xì)胞,CD4+T細(xì)胞,CD8+T細(xì)胞數(shù)量明顯增加,組織中IL-1釋放增多,從而引起炎癥級聯(lián)反應(yīng),加重腸黏膜損傷。4.腸上皮細(xì)胞LAMP2A過表達(dá)后小鼠菌群結(jié)構(gòu)的改變可能增加DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎的易感性:LAMP2A-IECKI小鼠菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,其中Escherichia/Shigella等IBD相關(guān)致病菌的豐度增加。結(jié)論腸上皮細(xì)胞LAMPA2A過表達(dá)后可顯著增強(qiáng)細(xì)胞CMA功能,一方面引起腸道內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)的改變,致病菌定植增多,使得小鼠易感性增加。另一方面,腸上皮細(xì)胞CMA增強(qiáng)后,可能通過釋放炎性介質(zhì),引起炎性浸潤從而加重小鼠的炎癥反應(yīng)。
【圖文】：

首先在體外構(gòu)建含有目的基因 Lamp2a 的載體，在目的基因片段上游設(shè)計(jì)了兩邊帶有 Lox P 位點(diǎn)的 STOP 終止子位點(diǎn)。之后采用胚胎干細(xì)胞技術(shù)內(nèi)，將體外構(gòu)建好的這段基因片段轉(zhuǎn)入胚胎干細(xì)胞（embryonic stemcell，ES 細(xì)胞）內(nèi)，使基因片段插入到 ROSA26 啟動子范圍內(nèi)，，如圖 1 所示。最后將 ES 細(xì)胞植入假孕小鼠子宮，最終發(fā)育成為完整胚胎。其次，利用胚胎干細(xì)胞技術(shù)通過使用不同啟動子來調(diào)控 Cre 酶的表達(dá)，使得 Cre酶在特定部位產(chǎn)生，后 Cre 酶識別特異 Lox P 位點(diǎn)，催化其斷裂使目的基因前的 STOP序列敲掉，以此便可以實(shí)現(xiàn)相應(yīng)條件下某一特定基因的過表達(dá)。基于在研究 IBD 模型過程中，腸上皮細(xì)胞發(fā)揮了主要功能，所以本課題采用可以腸上皮細(xì)胞特異性Villin-Cre 小鼠�；蚬こ碳芭咛スこ碳夹g(shù)方面的工作如目的基因片段設(shè)計(jì)及構(gòu)建，ES 電轉(zhuǎn)，ES細(xì)胞克隆篩選和胚胎干細(xì)胞技術(shù)等步驟均委托北京百奧賽圖公司完成。相關(guān)構(gòu)建策略如圖 1 所示。

空軍軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文MP2A 腸上皮特異性過表達(dá)小鼠的繁育過程性 ROSA26-Stopfloxed-Lamp2a（+/-）小鼠與 Villin-C行交配繁殖，如圖 2 所示。F1 代小鼠周齡達(dá)到三周時(shí)，F(xiàn)1 代小鼠中 Lamp2a 基因和 Villin-Cre 酶基因同時(shí)表 穩(wěn) 定 的 LAMP2A 小 鼠 腸 上 皮 特 異 性 過 表 達(dá) 6-Stopfloxed-Lamp2a mice, LAMP2A-IECKI 小鼠）。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R574

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本文編號：2693680