【摘要】： [目的]探討一種經(jīng)濟(jì)易行的大鼠肝星狀細(xì)胞的分離與培養(yǎng)方法,為今后從細(xì)胞及分子水平上研究肝纖維化的發(fā)病機(jī)理提供有利條件。 [方法]取成年大鼠,用兩步酶液對其肝臟進(jìn)行離體循環(huán)灌注,經(jīng)兩種密度的Nycodenze密度梯度高速離心(20000r／min)和細(xì)胞懸液低速離心(40×g)去雜質(zhì)后得到原代HSCs。臺(tái)盼蘭拒染實(shí)驗(yàn)鑒定細(xì)胞活率,des min和GFAP免疫細(xì)胞化學(xué)雙抗單染色法鑒定剛分離的肝星狀細(xì)胞的純度。(?)-SMA免疫細(xì)胞化學(xué)AEC顯色鑒定培養(yǎng)7天的細(xì)胞活化程度。 [結(jié)果]HSCs的得率為(3.6±0.1)×107／肝,HSCs存活率為(92.8±0.8)%,對培養(yǎng)24小時(shí)的HSCs行des min和GFAP共同鑒定DAB顯色,細(xì)胞陽性率為(96.2±0.5)%；取培養(yǎng)7天的細(xì)胞爬片做(?)-SMA做HSCs的活化鑒定AEC顯色,細(xì)胞陽性率為(72.3±0.6)%。 [結(jié)論]改良法在保障大鼠原代HSCs產(chǎn)量的前提下提高了細(xì)胞純度,有利于對原代大鼠HSCs生物學(xué)特性及肝纖維化機(jī)制的進(jìn)一步研究。 [目的]觀察內(nèi)毒素刺激大鼠原代HSCs后TGF-β1表達(dá)的影響,探討PDTC(NF-κB抑制劑)改善肝纖維化的機(jī)制。 [方法]用鏈酶蛋白酶液和膠原酶液離體灌注消化健康成年大鼠肝臟,Nycodenze密度梯度離心,得到原代HSCs,在含有內(nèi)毒素終濃度分別為0.01、0.1、1、10μg／ml的培養(yǎng)液中培養(yǎng),各濃度組分別在培養(yǎng)第2、4、8天時(shí)收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液,-20℃保存,Elisa法測定TGF-β1含量。在含有各濃度內(nèi)毒素的培養(yǎng)液中分別在第2、4、8天換成含PDTC終濃度為10pmol／L且含有原濃度內(nèi)毒素的培養(yǎng)液,對照組在第2、4、8天時(shí)換成只含有原濃度內(nèi)毒素未加PDTC的培養(yǎng)液,48小時(shí)后,收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液-20℃保存,Elisa法測定TGF-β1含量。 [結(jié)果]內(nèi)毒素直接刺激HSCs,分別在第2、4、8天測得的TGF-β1含量均高于對照組,且1μg／ml組TGF-β1的表達(dá)升高最多,其次為0.1μg／ml組,10μg／ml組和0.01μg／ml組。加入PDTC后,各組TGF-β1的表達(dá)量均低于對照組。 [結(jié)論]一定濃度的內(nèi)毒素直接作用原代HSCs使其TGF-β1表達(dá)增加,提示內(nèi)毒素可直接引起HSCs的活化,這可能是內(nèi)毒素促進(jìn)肝纖維化的途徑之一。PDTC直接作用于HSCs可使TGF-β1表達(dá)降低提示我們PDTC可能是通過抑制核因子κB降低TGF-β1的表達(dá)來改善肝纖維化的,核因子κB可能是其靶點(diǎn)之一。
【圖文】：

結(jié)果1獄咒污整個(gè)自然活化過程的形態(tài)學(xué)觀察在倒置顯微鏡下，剛分離出的月百O邊界清楚，，細(xì)胞呈圓形，透亮，折光性強(qiáng)數(shù)小時(shí)后看見細(xì)胞部分貼壁，24小時(shí)后細(xì)胞體積稍許增大，折光性較前減弱，48看見細(xì)胞開始伸出偽足，有的呈梭形，有的呈蛾蚌狀。7天后細(xì)胞變長，胞體較大，型的活化細(xì)胞樣。培養(yǎng)14天后，細(xì)胞全部活化(見圖1，2)。2月國C，的產(chǎn)量、活度及性質(zhì)鑒定本方法采用兩步酶消化法，用兩種不同濃度的抑‘口denze得到未活化的月谷。，只大鼠體重3009，產(chǎn)量達(dá)(3.6士0.1)x107/肝，0.4%臺(tái)盼蘭拒然實(shí)驗(yàn)鑒定活細(xì)胞率為士0.8)%，取培養(yǎng)24小時(shí)的細(xì)胞爬片進(jìn)行de:min和GF通尸〔，’一l2]共同鑒定DAB染色，胞率為(%.2士0.5)%(見圖3，);取培養(yǎng)7天的細(xì)胞爬片做a一SMA做HSCS的活化鑒顯色，取培養(yǎng)7天的細(xì)胞爬片做a一S撇做HSCs的活化鑒定AEC顯色，細(xì)胞陽性率為士0.6)%(見圖4，5)圖1:剛分離的月污食(x250)o
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R575.2

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本文編號：2691850