【摘要】： 重癥肝炎的病死率非常高,病情發(fā)展迅速、兇險(xiǎn),臨床預(yù)后差,盡管對(duì)其致病機(jī)制等展開了大量的研究工作,但目前對(duì)其致病機(jī)理仍不十分清楚。鑒于臨床重癥肝炎致病因素多樣,肝損傷機(jī)理復(fù)雜,不同誘因所引起的重癥肝炎在病理?yè)p傷、致病機(jī)理既有相似之處,也有不同的方面。因此,建立由不同因素引起的動(dòng)物模型對(duì)深入開展重癥肝炎急性肝損傷的機(jī)制研究具有重要意義。補(bǔ)體是機(jī)體免疫防御的第一道防線,但補(bǔ)體的過(guò)度激活又是造成免疫病理性損傷的介質(zhì)。補(bǔ)體在重癥肝炎免疫病理?yè)p傷及發(fā)病機(jī)制中的生物學(xué)作用還少見報(bào)道。 本研究建立LPS/D-GalN誘導(dǎo)小鼠重癥肝炎急性肝損傷和MHV-3病毒感染小鼠重癥肝炎急性肝損傷動(dòng)物模型,研究這兩種模型,并利用C3缺陷鼠(C3-/-)、靶向補(bǔ)體抑制劑(CR2-FH)阻斷補(bǔ)體旁路激活途徑以及阻斷補(bǔ)體片段C3a與其受體C3aR的結(jié)合等方面探索補(bǔ)體介導(dǎo)的免疫病理?yè)p傷在重癥肝炎急性肝損傷中的作用,為探索臨床干預(yù)治療提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。 一、補(bǔ)體在LPS/D-GalN誘導(dǎo)小鼠重癥肝炎急性肝損傷中的作用研究 1、LPS/D-GalN誘導(dǎo)小鼠重癥肝炎急性肝損傷模型建立:以不同劑量LPS/D-GalN腹腔注射C57BL/6小鼠,觀察存活時(shí)間及肝臟損傷大病理,確定實(shí)驗(yàn)LPS/D-GalN使用劑量。并在不同時(shí)間點(diǎn)觀察模型肝組織病理?yè)p傷,檢測(cè)血清中ALT表達(dá)水平以及炎癥因子水平。結(jié)果顯示該模型呈現(xiàn)重癥肝炎急性肝損傷進(jìn)程性病變。該模型穩(wěn)定、易行,可為急性肝損傷的實(shí)驗(yàn)研究提供理想的免疫病理?yè)p傷模型。 2、補(bǔ)體在重癥肝炎急性肝損傷免疫病理研究:采用免疫組化技術(shù)檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)各組小鼠肝組織中C3的沉積與分布,Real Time PCR技術(shù)檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)肝組織補(bǔ)體受體C3aR、C5aR表達(dá)水平變化。結(jié)果顯示,與正常C57BL/6小鼠組相比,染毒小鼠的補(bǔ)體C3在肝臟組織的沉積呈動(dòng)態(tài)變化,1h時(shí)沉積增加,主要沉積在肝中央靜脈周圍,但4h時(shí)表達(dá)減少,8h時(shí)再次達(dá)高峰,主要沉積在組織壞死區(qū)域。同時(shí),C3aR表達(dá)水平1h時(shí)升高,4h下降,8h時(shí)再達(dá)高峰。C5aR表達(dá)水平持續(xù)升高,8h時(shí)達(dá)高峰。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明小鼠染毒后肝組織損傷的程度與補(bǔ)體成分在肝內(nèi)表達(dá)情況密切相關(guān),補(bǔ)體的過(guò)度激活導(dǎo)致肝組織補(bǔ)體C3沉積的增加,并誘導(dǎo)C3aR、C5aR在肝細(xì)胞的異常表達(dá)。 3、阻斷補(bǔ)體激活途徑在LPS/D-GalN誘導(dǎo)小鼠重癥肝炎急性肝損傷模型中的作用研究 (1)阻斷補(bǔ)體C3激活途徑減輕小鼠重癥肝炎急性肝損傷:采用LPS(50ng)/D-GalN(6mg)腹腔注射C3-/-小鼠及C57BL/6小鼠,比較兩組小鼠急性肝損傷的差異:觀察肝組織病理HE染色及檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)(0h、1h、4h、8h)血清中炎癥因子和ALT表達(dá)水平變化,比較兩組小鼠存活率。結(jié)果顯示,同一時(shí)間點(diǎn)的炎癥因子IL-6、MCP-1及TNF-α表達(dá)水平C57BL/6小鼠要高于C3-/-小鼠,且C3-/-小鼠的病情嚴(yán)重程度要明顯輕于C57BL/6小鼠,病程發(fā)展也要較C57BL/6小鼠緩慢。同時(shí),阻斷補(bǔ)體C3激活途徑能延長(zhǎng)小鼠生存率。實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明補(bǔ)體在LPS/D-GalN誘導(dǎo)小鼠重癥肝炎急性肝損傷中發(fā)揮著重要作用。 (2)阻斷C3a與其受體C3aR結(jié)合減輕小鼠重癥肝炎急性肝損傷:腹腔注射LPS/D-GalN前45min和后45min,尾靜脈注射C3aR阻斷劑40μg/只。觀察各時(shí)間小鼠肝組織病理、血清ALT及血清炎癥因子表達(dá)水平;并比較C3aR阻斷小鼠與C57BL/6小鼠存活率。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示C3aR阻斷小鼠的存活時(shí)間明顯長(zhǎng)于C57BL/6小鼠。肝組織病理學(xué)顯示C3aR阻斷小鼠的肝損傷進(jìn)程明顯比C57BL/6小鼠緩慢,其病理?yè)p傷程度也比C57BL/6小鼠輕。C57BL/6小鼠的IL-6、TNF-α明顯高于C3aR阻斷小鼠。各時(shí)間點(diǎn)補(bǔ)體C3在C3aR阻斷小鼠肝組織沉積較C57BL/6小鼠減少。因此,阻斷C3a和其受體C3aR的結(jié)合,可降低急性肝損傷時(shí)炎癥因子的升高,從而減低或推遲炎癥因子介導(dǎo)機(jī)體的損傷。阻斷C3aR有利于減輕急性肝損傷模型的病理?yè)p傷及炎癥反應(yīng)。 (3)利用靶向補(bǔ)體抑制物CR2-FH阻斷補(bǔ)體旁路激活途徑減輕C57BL/6小鼠肝組織病理?yè)p傷:腹腔注射LPS/D-GalN,即刻尾靜脈注射CR2-FH,觀察不同時(shí)間點(diǎn)肝組織病理?yè)p傷及補(bǔ)體C3在肝組織的沉積。結(jié)果顯示,注射CR2-FH的小鼠其肝損傷進(jìn)程明顯緩慢于C57BL/6小鼠,其病理?yè)p傷程度也要比C57BL/6小鼠輕。 二、補(bǔ)體在MHV-3病毒感染小鼠重癥肝炎急性肝損傷模型中的作用和機(jī)制研究 1、MHV-3病毒感染C57BL/6小鼠重癥肝炎急性肝損傷模型建立:MHV-3腹腔注射C57BL/6小鼠,測(cè)定LD50及確定實(shí)驗(yàn)致死劑量。觀察模型肝組織病理?yè)p傷及檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)血清中ALT表達(dá)水平變化以及血清炎癥因子水平。同時(shí)檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)病毒滴度和病毒載量。結(jié)果顯示,本實(shí)驗(yàn)建立的MHV-3感染小鼠導(dǎo)致病毒性重癥肝炎急性肝損傷模型從肝組織病理學(xué)、血清ALT水平及炎癥因子、病毒復(fù)制等方面來(lái)看,其病變有一定的發(fā)展,符合病毒性急性重癥肝炎肝損傷發(fā)生發(fā)展的表現(xiàn)。能模擬肝炎病毒在肝組織內(nèi)的復(fù)制過(guò)程和引起的損傷情況。 2、補(bǔ)體激活介導(dǎo)MHV-3病毒感染C57BL/6小鼠重癥肝炎急性肝損傷:利用免疫組織化學(xué)、Real Time PCR等方法檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)小鼠肝組織中C3的沉積與分布及補(bǔ)體受體C3aR、C5aR表達(dá)水平變化。結(jié)果表明,與正常C57BL/6小鼠相比,補(bǔ)體C3水平在染毒后6h升高,12h達(dá)到高峰,但24h開始小鼠肝組織C3沉積減少,但72h時(shí)再次增加,且主要沉積在肝壞死區(qū)域。同時(shí),C3aR、C5aR表達(dá)水平均呈先上升,再下降,再在72h升高的趨勢(shì),C3aR的第一個(gè)表達(dá)高峰在12h,而C5aR在6h。其結(jié)果都表明補(bǔ)體的激活與MHV-3感染小鼠致重癥肝炎急性肝損傷密切有關(guān)。 3、阻斷補(bǔ)體激活途徑在MHV-3感染小鼠重癥肝炎急性肝損傷模型中的作用研究: (1)阻斷補(bǔ)體C3激活途徑加重小鼠重癥肝炎急性肝損傷:采用致死劑量的MHV-3病毒分別感染C3-/-小鼠及C57BL/6小鼠,比較兩組小鼠急性肝損傷的差異。結(jié)果顯示,在MHV-3感染小鼠重癥肝炎急性肝損傷模型中,從組織病理學(xué)、血清生化、炎癥因子及病毒復(fù)制等方面來(lái)看,雖然兩組生存率之間沒(méi)有差異(P0.05),但C3-/-小鼠的病程發(fā)展要快于C57BL/6小鼠,且同一時(shí)間點(diǎn)的病情也比C57BL/6小鼠嚴(yán)重。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在病毒性的急性肝損傷模型中,補(bǔ)體系統(tǒng)的激活可能對(duì)病毒發(fā)揮調(diào)理作用,抑制病毒復(fù)制和擴(kuò)散,對(duì)機(jī)體主要起積極保護(hù)作用。 (2)阻斷C3a與其受體C3aR結(jié)合加重小鼠重癥肝炎急性肝損傷:建立C3aR阻斷小鼠感染MHV-3致重癥肝炎急性肝損傷模型,雌性C57BL/6小鼠48只,先尾靜脈注射C3aR阻斷劑40μg/只,1h后注射MH V-3病毒,間隔12h、36h后再分別注射C3aR阻斷劑一次,劑量仍為40μg/只。研究結(jié)果表明,C57BL/6小鼠肝組織病變進(jìn)程明顯緩慢于C3aR阻斷小鼠,補(bǔ)體C3在C57BL/6小鼠肝臟組織的沉積明顯強(qiáng)于C3aR阻斷小鼠。綜上所述,從組織病理學(xué)、血清生化、炎癥因子及病毒復(fù)制等方面來(lái)看,C3aR阻斷小鼠的病程發(fā)展介于C3-/-小鼠與C57BL/6小鼠之間,且同一時(shí)間點(diǎn)的病情嚴(yán)重程度也介于兩者之間。比C57BL/6小鼠嚴(yán)重,卻比C3-/-小鼠稍輕。進(jìn)一步提示C3a作為調(diào)理素在機(jī)體抗病毒方面也發(fā)揮重要作用。 通過(guò)上述兩部分比較系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn),本研究發(fā)現(xiàn),在LPS/D-GalN誘導(dǎo)小鼠重癥肝炎急性肝損傷中,補(bǔ)體主要由旁路途徑激活,其激活過(guò)程中產(chǎn)生的過(guò)敏毒素,能促進(jìn)炎癥的發(fā)生,同時(shí)補(bǔ)體能介導(dǎo)自身靶細(xì)胞的損傷,導(dǎo)致靶細(xì)胞的壞死;用靶向補(bǔ)體抑制劑CR2-FH能一定程度上阻斷補(bǔ)體旁路途徑的激活,減輕補(bǔ)體介導(dǎo)的免疫病理?yè)p傷。補(bǔ)體介導(dǎo)的免疫病理?yè)p傷在LPS/D-GalN誘導(dǎo)的小鼠重癥肝炎急性肝損傷中發(fā)揮重要的致病作用。在MHV-3病毒感染急性肝損傷中,補(bǔ)體激活產(chǎn)生的調(diào)理素可促進(jìn)吞噬細(xì)胞對(duì)病毒的吞噬作用,阻止病毒進(jìn)入靶細(xì)胞,抑制病毒復(fù)制,減輕肝組織損傷;在由該類病毒性病原引起的重癥肝炎肝組織損傷發(fā)病中,補(bǔ)體不是病理?yè)p傷的因素,而是通過(guò)抑制病毒復(fù)制,對(duì)機(jī)體起一定的保護(hù)作用。這與補(bǔ)體在LPS/D-GalN誘導(dǎo)的重癥肝炎發(fā)病中介導(dǎo)的免疫病理?yè)p傷是完全不同的。
【圖文】：

alN 誘導(dǎo) C57BL/6 小鼠急性肝損傷模型鼠肝組織病理變化以LPS/D-GalN誘導(dǎo)C57BL/6小鼠建立重癥肝炎急性肝損傷動(dòng)病理學(xué) HE 染色檢查顯示，隨著染毒時(shí)間的延長(zhǎng)，該模型 C57急性漸進(jìn)式發(fā)展。正常小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清楚，隨時(shí)間推移，枯胞增多，肝細(xì)胞灶性嗜伊紅性增加，肝組織由散在的點(diǎn)狀灶性疏松及單個(gè)細(xì)胞凋亡發(fā)展至彌漫性的大面積壞死，細(xì)胞核崩解構(gòu)。A BA：正常C57BL/6小鼠 B：C57BL/6小鼠注射L/D 1hC：C57BL/6小鼠注射L/D 4h D：C57BL/6小鼠注射L/D 8h

免疫組化的方法，檢測(cè)補(bǔ)體 C3 在肝組織的沉積和分布。 C3 在肝內(nèi)表達(dá)情況：與正常 C57BL/6 小鼠比較，，染毒小鼠在間質(zhì)、肝小葉四周表達(dá)增強(qiáng)，沉積顏色加深，但 4 h 時(shí)著色變體 C3 在肝組織的表達(dá)再次升高，尤其沉積在壞死區(qū)域。從損死，隨著病變加重，補(bǔ)體 C3 的表達(dá)水平也是動(dòng)態(tài)的演變過(guò)程在肝膽管、中央靜脈周圍發(fā)展至沉積在肝實(shí)質(zhì)壞死區(qū)域，說(shuō)肝損傷密切有關(guān)。A B正常C57BL/6小鼠 C57BL/6小鼠染毒1hC57BL/6小鼠染毒4hC57BL/6小鼠染毒8h
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R575.1

【引證文獻(xiàn)】

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1 馮藝萍;;天然藥物抗急性肝損傷研究進(jìn)展[J];現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生;2011年21期

本文編號(hào)：2690262