【摘要】： 研究背景和目的:PD是ESRD患者的主要腎替代治療方法之一。但是長期暴露于生物不相容性的PDF中的腹膜易損傷,逐漸進展為腹膜纖維化,導致超濾失敗,溶質清除障礙,影響PD療效。高糖環(huán)境上調TGF-β_1的表達并誘導HPMCs發(fā)生EMT是腹膜纖維化啟動和維持的關鍵過程。而目前認為HGF和TGF-β_1之間的平衡在決定損傷組織是痊愈還是纖維化起著關健的作用。眾多研究表明,HGF是內在的抗纖維化因子。本研究主要探討外源性HGF能否影響高糖環(huán)境培養(yǎng)下的HPMCs的TGF-β_1表達,并阻止HPMCs發(fā)生EMT,減少ECM的合成。探討HGF對腹膜纖維化的防治作用,為保護長期PD患者的腹膜功能提供新的治療策略。 方法:通過胰蛋白酶消化法從人大網膜組織中分離出HPMCs并進行原代培養(yǎng),通過形態(tài)學和免疫組化進行腹膜間皮細胞鑒定,取第三代細胞用于實驗。細胞亞融合后在無血清培養(yǎng)基中同步化24小時,然后在不同葡萄糖濃度環(huán)境(5.5,30,60mmol/LD-葡萄糖,54.5mmol/L甘露醇)及高糖環(huán)境中(60mmol/L D-葡萄糖)加入不同濃度的rhHGF(25,50,100ng/ml)培養(yǎng)48小時。ELISA方法檢測細胞培養(yǎng)上清液TGF-β_1、FN蛋白水平,免疫組化方法檢測HPMCs之α-SMA的蛋白表達,并通過IOD測定進行半定量分析。通過熒光定量PCR檢測HPMCs之TGF-β_1,FN,α-SMA mRNA的表達。 結果:1、原代培養(yǎng)的HPMCs開始以梭形的成纖維細胞樣生長,約一周后融合并表現(xiàn)為“鋪路石”狀,免疫組化顯示角蛋白和波形蛋白表達陽性。2、在高糖環(huán)境培養(yǎng)下的HPMCs之α-SMA、TGF-β_1、FN蛋白和基因表達水平與對照組比較都明顯增加(P＜0.05),并呈劑量依賴關系(P＜0.01)。甘露醇組與對照組比較無明顯增加。3、HGF在蛋白和基因水平可抑制高糖誘導的HPMCs之α-SMA、TGF-β_1、FN表達(P＜0.05),并呈劑量依賴關系(P＜0.01)。 結論:1、HPMCs在高糖環(huán)境培養(yǎng)下,TGF-β_1的表達上調,并誘導了HPMCs的EMT,促進HPMCs合成ECM。2、外源性的HGF可抑制高糖誘導的HPMCs TGF-β_1的表達,并阻止HPMCs的EMT和減少ECM的分泌,提示HGF具有抑制腹膜纖維化的生物學功能,為臨床防治PD相關的腹膜纖維化提供理論依據(jù)和新的治療思路。
【圖文】：

1.細胞生長情況原代消化下的細胞在12一36小時后逐漸貼壁并完全伸展，細胞開始以梭形的成纖維細胞樣生長，細胞形態(tài)、大小不一(見圖1一l)。經6一7天的培養(yǎng)后，細胞生長并逐步融合成單層，細胞表現(xiàn)為多邊形的上皮細胞形態(tài)，大小形態(tài)較為一致，在倒置相差顯微鏡下顯示呈現(xiàn)典型的“鋪路石樣”外觀(見圖1一2，1一3)。上述生長特點符合文獻報道的腹膜間皮細胞的生長特征[9一‘0]。2.免疫組織化學染色鑒定免疫組化結果顯示，培養(yǎng)的第二代人腹膜間皮細胞角蛋白、波形蛋白抗原表達均陽性(見圖1一4，1一5)，兩種染色均為胞漿著色，呈棕黃色，胞核中未見，這兩種蛋白同時陽性被認為是間皮細胞的特征，排除成纖維細胞。第VIII因子相關抗原、白細胞CD45抗原表達陰性(見圖1一6)

在低濃度的葡萄糖環(huán)境培養(yǎng)下，只有少量的HPMCs表達a一SMA，隨著葡萄糖濃度的增高，a一SMA陽性HPMCs細胞數(shù)明顯增多，并巨一些陽性細胞明顯肥大、拉長，部分有多個細胞核(見圖2一1一2一4)，通過軟件測得各組表達a一SMA陽性區(qū)域IOD值顯示，兩個高糖組的平均IOD值較低糖對照組明顯升高，并有統(tǒng)計學差異(P<O.01)，甘露醇組與低糖對照組比較無顯著性差異(P=0.078)，而且平均IOD值與葡萄糖濃度呈劑量依賴正相關(r=0.960，P<0.01)，見表2一l。2.HGF對高糖環(huán)境培養(yǎng)下的班姍Cs表達Q一SMA的影響在高糖環(huán)境培養(yǎng)下的HPMCs加入不同濃度HoF后
【學位授予單位】：福建醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R587.2;R572

【參考文獻】

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1 凌光輝;劉伏友;彭佑銘;段紹斌;李軍;陳星;;短發(fā)夾結構RNA對人腹膜間皮細胞轉化生長因子-β_1表達和超微結構的影響[J];中國血液凈化;2007年09期

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本文編號：2688818