【摘要】：由于生活水平日益提高,飲食結構的變化和預防保健措施的相對滯后,肝纖維化已經(jīng)成為一種全球性病癥,尤其我國,其發(fā)病率有明顯增高的趨勢。肝纖維化研究的重要性在于：(1)肝纖維化是各種肝病發(fā)展成肝硬化的必經(jīng)病理過程；(2)肝纖維化是阻止發(fā)展肝硬化過程中唯一可靠的治療時機；(3)世界范圍內(nèi)對慢性肝病治療的兩大策略即抗病毒治療和阻止肝纖維化的發(fā)生。目前,尚無特效抗病毒療法治療慢性病毒性肝炎。因此,肝病的治療重點轉移到如何防止肝纖維化以致肝硬化的發(fā)生、發(fā)展方面,隨之而來的是對肝纖維化發(fā)生機制的研究。 肝纖維化是由各種致病因子如酒精、乙肝病毒等所致肝內(nèi)損傷組織修復過程中的代償性反應,表現(xiàn)為肝臟內(nèi)纖維結締組織的細胞外基質(zhì)(Extra cellular matrix, ECM)過度沉淀。肝星狀細胞(Hepatic stellate cells, HSC)的活化和增殖是肝纖維化形成的中心環(huán)節(jié)。肝細胞損傷的其中一個重要機制是由于細胞受到外源或內(nèi)源性刺激產(chǎn)生的氧化應激(oxidative stress, OS),導致細胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species, ROS)過度產(chǎn)生,與膜磷脂的多不飽和脂肪酸發(fā)生氧化反應形成脂質(zhì)過氧化物(lipoperoxides, LPO)。LPO可直接損害細胞膜并導致細胞死亡,并且可抑制抗氧化系統(tǒng),削弱細胞防御機制。最重要的是其可激活HSC細胞,誘導HSC產(chǎn)生大量膠原蛋白,促進肝纖維化的發(fā)生。幾乎所有臨床和實驗性肝纖維化都被證實與氧化應激有關,而抗氧化劑可以減慢或阻止肝纖維化的發(fā)展。 細胞珠蛋白(Cytoglobin, Cygb)作為一種細胞內(nèi)抗氧化蛋白,是最初由日本Tawada等在2001年在大鼠纖維化肝臟的星狀細胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)了此種蛋白。其基因定位于染色體17q25,含有4個外顯子和3個內(nèi)含子,編碼190個氨基酸殘基,分子量20.9KDa,擁有經(jīng)典的螺旋三明治折疊結構。由于其緊湊的螺旋形結構和結合血紅素的能力,Cygb可可逆的結合各類氣體分子,如氧氣、一氧化氮等。Cygb在缺氧時表達上調(diào)且特定地表達在毛細血管周圍,提示其可能具有氧感受器的作用。Cygb可作為清道夫,清除組織缺血后再灌注時產(chǎn)生的ROS和N0分子。此外,Cygb具有過氧化氫酶活性,在肝星狀細胞中起過氧化物清除劑的作用。最近有研究顯示,Cygb對肝纖維化的逆轉有著非常顯著的作用。 由本實驗室構建的肝纖維化大鼠模型中,注射了Cygb的治療組與未注射Cygb的對照組相比,前者纖維化肝臟組織有了明顯的逆轉。研究證明Cygb作為一種源于人體大部分內(nèi)臟器官的正常蛋白,其毒副作用小,在抗肝纖維化的臨床治療中將占有重要地位。因此,本研究著重于研究Cygb在肝纖維化中抗氧化作用的分子機制從而找到其治療肝纖維化的具體信號通路。 有研究顯示Cygb廣泛分布各臟器中,主要表達于結締組織成纖維細胞中,如肝星狀細胞、成軟骨細胞等。由于國際上對Cygb在細胞內(nèi)的確切亞定位仍存在爭議,其常用的定位方式是利用綠色熒光蛋白標簽(Green Fluorescent Portein, GFP)。因此,本實驗利用FLAG標簽(8個氨基酸殘基)結合細胞免疫熒光實驗,對照GFP標簽的定位方式來驗證Cygb在肝星狀細胞中的確切定位。 目前國際上對Cygb能有效抗纖維化的具體機制和通路不甚明了,因此本研究建立優(yōu)化的免疫沉淀(Immunoprecipitation,IP)結合雙向電泳-質(zhì)譜的方法來尋找與Cygb相互作用的蛋白,分析這些相互作用蛋白已知的功能和分子通路,間接預測出珠蛋白在治療肝纖維化過程中的具體作用機制。 由于文獻報道,Cygb可能通過抑制氧化應激反應等方式抵御和逆轉肝纖維化進程。因此用一定濃度的H202刺激肝星狀細胞系(LX-2),構建細胞氧化應激模型。通過在不同時間點檢測氧化應激相關指標,觀察LX-2細胞氧化應激的發(fā)生、抵御和清除的大致時間分布。為了更清楚的研究LX-2細胞在氧化應激過程中Cygb與相關基因轉錄水平的變化,利用熒光定量PCR(Quantitative polymerase chain reaction, QPCR)的方法分別檢測在H202刺激下,不同時間點Cygb與其相互作用蛋白mRNA的表達情況,從而分析氧化應激對這些基因的影響以及基因間的相互關系。 根據(jù)以上目的,本研究細分三部分,第一部分是Cygb真核表達載體的構建、表達及在LX-2細胞中的定位,第二部分是免疫沉淀-雙向電泳-質(zhì)譜聯(lián)合方法的建立與篩選與Cygb相互作用的蛋白,第三部分是Cygb與其相互作用蛋白AKR7A2在H202誘導LX-2細胞氧化應激下的mRNA表達量變化。 第一部分通過提取人肝星狀細胞系(LX-2)總RNA,逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)獲得Cygb的cDNA,以cDNA為模板使用PCR法擴增得到Cygb編碼序列。將其酶切后分別連接至帶有GFP標簽和帶有FLAG標簽的真核表達載體上,酶切與測序鑒定其陽性克隆。隨后將重組質(zhì)粒pEGFP-N1-Cygb和pcDNA3.0-Cygb-FLAG分別瞬時轉染LX-2細胞,經(jīng)Western-blot鑒定兩組表達情況。轉染GFP標簽載體48h后直接在倒置熒光顯微鏡下觀察；轉染FLAG標簽載體48h后進行細胞免疫熒光實驗,在倒置熒光顯微鏡下觀察熒光情況。通過兩組對照,分析Cygb在LX-2細胞中的確切定位。 結果顯示,將Cygb基因克隆到真核表達載體,經(jīng)PCR、雙酶切和測序等鑒定,成功構建了pEGFP-N1-Cygb和pcDNA3.0-Cygb-FLAG重組真核表達載體。分別用抗GFP抗體和抗FLAG抗體對表達產(chǎn)物進行Western-blot鑒定,發(fā)現(xiàn)特異性條分別帶出現(xiàn)在48KDa和21KDa處,成功在LX-2細胞中表達出特異性重組蛋白Cygb。采用脂質(zhì)體法瞬時轉染LX-2細胞48h,經(jīng)DAPI細胞核染色,在倒置熒光顯微鏡下檢測結果顯示：轉染了pEGFP-N1-Cygb的細胞中,表達的融合蛋白Cygb-GFP綠色熒光均勻分布在細胞質(zhì)和細胞核中,而轉染pcDNA3.0-Cygb-FLAG的細胞顯示Cygb-FLAG融合蛋白紅色熒光主要分布于除細胞核以外的細胞質(zhì)中。 第二部分通過傳統(tǒng)免疫沉淀方法與優(yōu)化的免疫沉淀結合雙向電泳的方法進行對比實驗,研究后者的方法能否成功篩選出相互作用蛋白。優(yōu)化中,為了減少了非特異性蛋白的干擾、達到雙向電泳前的低鹽狀態(tài)以及減少蛋白的損失,在傳統(tǒng)免疫沉淀的洗滌和洗脫步驟中,把普通離心管換成特殊離心柱子,在洗滌步驟的最后一步用20mmM的Tris溶液洗滌2次達到除鹽效果,并換成雙向電泳兼容的新洗脫液洗脫復合物。經(jīng)免疫沉淀-雙向電泳方法得到一個特異性蛋白點,經(jīng)(?)ALDI-TOF質(zhì)譜分析,再根據(jù)該蛋白的已知功能推斷Cygb的分子通路。 結果顯示,優(yōu)化的免疫沉淀結合雙向電泳的方法比傳統(tǒng)免疫沉淀更能減少雜蛋白對結果的影響。該方法成功找到與Cygb相互作用蛋白。經(jīng)質(zhì)譜鑒定,與Cygb相互作用的蛋白為黃曲霉素醛還原酶(Aflatoxin B1aldehyde reductase member2, AKR7A2).其屬于AKR7家族,定位于高爾基體,參與過氧化氫、醛和酮的解毒,具有超強的抗氧化應激能力,能有效減少脂質(zhì)過氧化反應產(chǎn)生的醛,甚至能緩解細胞中DNA損傷。其涉及的2個通路為Nrf2/ARE通路與PPARY通路。 第三部分建立H202誘導的細胞氧化應激模型,先用不同濃度的H202刺激LX-2細胞使其發(fā)生氧化應激,用CCK-8檢測細胞存活率情況,從而確定最優(yōu)H202的刺激濃度。然后用最優(yōu)H202濃度刺激LX-2細胞,在不同時間點檢測氧化應激相關指標ROS、NO、超氧化物陰離子,來確定LX-2細胞氧化應激的發(fā)生、抵御和清除的大致時間分布。同時,以該時間分布為依據(jù)選用Oh、2h、8h、24h、36h、48h時間點收集H202刺激后的LX-2細胞提RNA、逆轉錄后,通過QPCR的方法分別檢測的Cygb與AKR7A2基因的mRNA表達變化,分析氧化應激對這些基因的影響以及基因間的相互關系。 結果顯示：CCK-8實驗得到H202最優(yōu)刺激濃度為80μM。用該濃度刺激LX-2細胞,在倒置熒光顯微鏡下觀察ROS.NO和超氧化物陰離子的熒光強度：在5min內(nèi),細胞快速產(chǎn)生ROS、NO以及超氧化物陰離子,在30min-lh內(nèi)達到頂峰。ROS在2h后被細胞清除完全,而而NO、超氧化物陰離子則在12h后還能檢測得到。超氧化物陰離子在24h后被完全清除,NO則仍有微量殘留。QPCR結果顯示：在刺激2h后,AKR7A2迅速上調(diào)2.6倍,而Cygb在8h內(nèi)反而下調(diào)。12h后,Cygb上調(diào)到1.9倍并最終在48h上調(diào)到4.8倍。而AKR7A2在12h上調(diào)5.7倍,在24h下降到3.2倍,而在36h又升高到5倍。 綜合以上結果得出結論： 1.成功地構建了pEGFP-N1-Cygb和pcDNA3.0-Cygb-FLAG重組真核表達載體,并在LX-2細胞中表達出特異性重組蛋白Cygb。 2.可能由于GFP分子量大等多種原因,導致帶GFP標簽的融合蛋白定位與帶FLAG標簽的定位差異。結合文獻資料,帶FLAG標簽的融合蛋白定位結果更加可信,因此Cygb主要分布于細胞質(zhì)中,在細胞質(zhì)發(fā)揮主要功能。 3.成功建立免疫沉淀-雙向電泳-質(zhì)譜聯(lián)合方法,篩選出的黃曲霉素醛還原酶與Cygb相互作用。Cygb可能共同參與黃曲霉素醛還原酶涉及的Nrf2/ARE通路與PPAR γ通路,具有類似的抗氧化功能。甚至可能通過PPARγ信號通路及NF-κB通路等抑制HSC的增殖從而抑制肝纖維化的發(fā)生。 4.H2O2誘導LX-2細胞氧化應激模型,在幾分鐘后快速產(chǎn)生大量ROS,NO等,在24h后基本被清除完全。是由于在應激過程中,ROS主要通過細胞內(nèi)超氧化物歧化酶等抗氧化酶被迅速清除干凈。但Cygb由于NO等的抑制作用下在8h內(nèi)表現(xiàn)為下調(diào),在12h后開始上調(diào),Cygb的延后性很可能是因為在氧化應激的前期,并不是主要發(fā)揮抗氧化的功能,而是作為脂質(zhì)過氧化信號激活抗氧化系統(tǒng),如醛還原酶(AKRs)。因此可以推測Cygb作為信號分子與AKR7A2相互作用,促進了AKR7A2的抗氧化作用。而AKR7A2通過Nrf2/ARE信號通路,在氧化應激前期快速上調(diào),并一直處在一個較高的表達水平,快速清除脂質(zhì)過氧化反應產(chǎn)生的毒性醛、酮和過氧化物。由于AKR7A2的表達存在波動性,提示AKR7A2具有負反饋作用,使得其表達量維持在一定范圍內(nèi)。而Cygb具有NO雙加氧酶(nitric oxide dioxygenase, NOD)活性,能有效清除NO,因此在12h后與AKR7A2一同發(fā)揮抗氧化應激作用,修復氧化應激造成的細胞損傷,從而有效抑制肝纖維化甚至是轉歸。 綜上所述,本研究通過細胞內(nèi)定位,相互蛋白的篩選與氧化應激下Cygb與其相互作用蛋白mRNA的表達變化來初步探索細胞珠蛋白在肝纖維化中氧化應激的具體分子機制,為研究Cygb在細胞內(nèi)相關生物學功能和肝纖維化治療上提供新的理論基礎,也為探尋Cygb新靶點和尋找治療肝纖維化的藥物提供新思路。
【圖文】：

最重要的是LPO可激活Kupffer細胞，分泌多種細胞因子，，繼而激活HSC,介導HSC的分化增殖和膠原的合成,從而促進肝纖維化的發(fā)生[6]。（如圖1)1

圖2 PCR擴增Cygb基因Fig. 2 PCR amplification of Cygb gene；1. PCR 產(chǎn)物(pEGFP-Nl-Cygb 組）；2. PCR 產(chǎn)物（arker； Lane 1. PCR product (pEGFP-Nl-Cygb)；(pcDNAS. 0-Cygb-FLAG)Nl-Cygb 和 pcDNA3.0-Cygb-FLAG 重組P-Nl-Cygb 和 pcDNA3. 0-Cygb-FLAG 重組質(zhì)ygb進行雙酶切鑒定，其產(chǎn)物電泳可見約（圖3)。l和EcoR I對pcDNA3. O-Cygb-FLAG進行b和500bp?750bp之間有兩條帶（圖3)。
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R575

【參考文獻】

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本文編號：2686208