【摘要】：自身免疫性肝炎的發(fā)病率呈上升趨勢,已經(jīng)嚴重威脅到人類的健康。因此,對其發(fā)病機制和防病策略的研究越來越受到重視。近年來發(fā)現(xiàn),免疫調(diào)節(jié)機制在自身免疫性肝炎中起著重要的作用,免疫相關(guān)分子和細胞與疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。雖然已有一些與免疫相關(guān)的病因解釋,但是目前對于其發(fā)病的真正的免疫學(xué)機制尚未深入了解。因此,尋找到與其相關(guān)的免疫學(xué)發(fā)病原因?qū)τ谧陨砻庖咝约膊〉闹委熡兄匾闹笇?dǎo)作用。 Con A誘導(dǎo)的肝炎是急性肝炎的一個很好的動物模型。它模擬了人類自身免疫性肝炎的病理過程。在Con A誘導(dǎo)的自身免疫性肝炎小鼠體內(nèi),許多細胞因子升高,包括了(?)TNF-α, IL-6, IFN-γ, and IL-1。其中TNF-α在急性肝臟炎癥的組織損傷中起著重要的作用。在炎癥的早期階段,TNF-α直接導(dǎo)致了肝細胞損傷。實驗證明,在本模型中,阻斷TNF-α可以有效的保護小鼠,防止肝損傷的發(fā)生。由單核巨噬細胞,T細胞和B細胞分泌的IL-6具有廣泛的生物學(xué)活性,其在本模型的急性期階段也起著重要的作用。 新近研究發(fā)現(xiàn)：IL-17在自身免疫性肝炎患者的血清中上調(diào)表達,但是IL-17在該病中的作用機制不清楚。因此,我們的實驗以Con A誘導(dǎo)的自身免疫性肝炎為模型,分析IL-17在Con A誘導(dǎo)的自身免疫性肝炎中的表達,以及IL-17的表達在Con A誘導(dǎo)的自身免疫性肝炎中的作用,進一步分析產(chǎn)生IL-17的細胞亞群,初步探討IL-17在Con A誘導(dǎo)的自身免疫性肝炎中的作用機制,以期為自身免疫性肝炎防治提供新的理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。 第一部分IL-17在Con A誘導(dǎo)的自身免疫性肝損傷中的表達 我們以高劑量Con A處理小鼠建立自身免疫性肝損傷模型。尾靜脈給予小鼠高劑量的Con A, PBS處理組作為對照,12小時后檢測血清轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和肝病理損傷的變化。從血清學(xué)指標來看,Con A處理組小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶(ALT)水平較PBS處理組小鼠顯著升高；小鼠肝組織病理檢查結(jié)果顯示,Con A處理組顯示大量浸潤的炎性細胞在肝組織擴散并導(dǎo)致局部肝細胞壞死；PBS處理組沒有出現(xiàn)炎性細胞浸潤。另外,我們檢測了模型小鼠血清中TNF-α和IL-6的水平,作為導(dǎo)致組織損傷最重要的細胞因子TNF-α和IL-6在Con A處理組顯著升高。因此通過以上結(jié)果證明我們成功誘導(dǎo)了肝損傷,建立了Con A誘導(dǎo)的自身免疫性肝損傷模型。 為了了解IL-17在本模型中是否起作用,我們利用TaqMan探針的實時熒光定量PCR和ELISA技術(shù)檢測了IL-17在模型小鼠肝組織中的表達變化情況,同時比較了IL-17的表達水平與肝臟損傷程度的相關(guān)性。實驗結(jié)果表明,IL-17在Con A誘導(dǎo)的免疫性肝損傷組織中顯著上調(diào)表達,IL-17表達水平與肝臟損傷程度正相關(guān),提示IL-17表達與免疫性肝損傷具有一定的相關(guān)性,IL-17的上調(diào)表達可能參與了免疫性肝損傷的病理發(fā)生。 第二部分IL-17在Con A誘導(dǎo)的自身免疫性肝損傷中的作用 通過第一部分的實驗證明在Con A誘導(dǎo)的自身免疫性肝損傷小鼠肝臟局部,IL-17增多。在本部分中,我們著重研究IL-17在本模型中所起的作用。首先,我們進行了特異性IL-17單克隆抗體的體內(nèi)阻斷實驗,觀察肝臟病理變化,檢測ALT水平、TNF-α和IL-6表達變化,評估抗IL-17單克隆抗體對Con A誘導(dǎo)的自身免疫性肝損傷的影響,初步探討它的可能機理。實驗結(jié)果表明,特異性IL-17單克隆抗體干預(yù)明顯降低了血清ALT水平(p0.05)、改善了肝臟病理損傷、降低了肝臟組織中促炎癥物質(zhì)如TNF-α和IL-6的表達水平。這些實驗資料說明,抗IL-17單克隆抗體對Con A誘導(dǎo)的自身免疫性肝損傷具有明顯的保護作用,IL-17促進相關(guān)的炎癥細胞因子TNF-α和IL-6的釋放可能是導(dǎo)致肝臟損傷的重要機制之一。其次,為了進一步了解內(nèi)源性IL-17在Con A誘導(dǎo)的急性肝損傷中的作用,我們用表達可溶性的IL-17R:Fc融合蛋白重組腺病毒載體(AdIL-17R:Fc)處理小鼠。這種融合蛋白可以與IL-17R結(jié)合,從而阻斷IL-17的傳導(dǎo)通路。結(jié)果顯示,經(jīng)可溶性的IL-17R：Fc融合蛋白重組腺病毒載體處理后,血清中轉(zhuǎn)氨酶水平明顯降低同時肝細胞壞死減輕。同時,與肝損傷水平相平行,可溶性的IL-17R：Fc融合蛋白重組腺病毒載體阻斷IL-17與其受體結(jié)合后,TNF-α和IL-6明顯下降。以上結(jié)果提示,阻斷IL-17信號通路可以明顯地減輕Con A誘導(dǎo)的急性肝損傷,并且此過程與阻斷了在本模型中重要的細胞因子TNF-α和IL-6相關(guān)。 最后,我們構(gòu)建了含有細胞因子IL-17的真核表達質(zhì)粒。我們以鈣轉(zhuǎn)法將質(zhì)粒導(dǎo)入Huh7細胞,獲得含IL-17轉(zhuǎn)染細胞。將以上轉(zhuǎn)染細胞的表達上清濃縮后進行ELISA分析可見明顯IL-17表達,證實以上所構(gòu)建的重組質(zhì)粒能夠在體外進行有效表達。體內(nèi)實驗顯示：該質(zhì)粒注射小鼠后,小鼠體內(nèi)的IL-17明顯升高。以上結(jié)果提示：所有構(gòu)建的重組質(zhì)�？稍隗w內(nèi)外得到有效表達。尾靜脈高壓注射質(zhì)粒pcDNA3.1-IL-17上調(diào)小鼠體內(nèi)的IL-17,明顯的加重了模型小鼠的肝損傷程度。實驗結(jié)果證明,血清ALT較對照組明顯增高,并且伴有肝臟細胞壞死面積擴大。更重要的是,相關(guān)炎癥細胞因子TNF-α和IL-6也較對照組明顯升高。這些數(shù)據(jù)提示,IL-17與Con A誘導(dǎo)的自身免疫性肝炎有著密切的關(guān)系。 第三部分Con A誘導(dǎo)的自身免疫性肝損傷中IL-17的來源 我們已經(jīng)證明IL-17在Con A誘導(dǎo)的自身免疫性肝炎中起著重要的作用。鑒于以上原因,研究本模型中IL-17的細胞來源對于自身免疫性肝炎的發(fā)病機制的研究具有重要的意義。我們檢測了Con A誘導(dǎo)的自身免疫性肝炎模型中肝臟局部的單個核細胞分泌IL-17的情況,實驗結(jié)果顯示,肝臟局部分泌IL-17的細胞比例較對照組明顯升高,所以我們認為在肝臟損傷中起著作用的IL-17是肝臟局部細胞分泌的。 鑒于此,我們首先檢測了Con A誘導(dǎo)的自身免疫性肝損傷中分泌IL-17的T細胞,我們發(fā)現(xiàn)在模型小鼠的肝臟中分泌的IL-17的T細胞比例,與前述測得的其在總細胞中的比例一致,這提示,肝臟局部分泌IL-17的細胞主要是T細胞。因此,我們在T細胞的基礎(chǔ)上,由熒光標記的抗CD4與抗CD8抗體染色檢測了不同的T細胞亞群分泌IL-17的情況。實驗結(jié)果提示,IL-17主要是由CD4+CD8-和CD4-CD8-這兩群T細胞分泌的,表示這肝臟局部產(chǎn)生IL-17的細胞來源存在著通常意義上的Th17細胞,即分泌IL-17的CD4+T細胞。但是,這里還存在著一群異于常規(guī)的分泌IL-17的細胞群,既CD4-CD8-T細胞亞群。 同時我們發(fā)現(xiàn),NKT細胞的數(shù)量和比例在肝臟中Con A處理組較對照組明顯升高。進一步我們檢測了這些細胞中IL-17的表達情況,細胞內(nèi)染色表明,表達IL-17的NKT細胞在Con A處理組較PBS對照組也明顯升高。這些結(jié)果提示,CD4+T和NKT細胞是Con A誘導(dǎo)的自身免疫性肝炎中IL-17的主要來源。 第四部分IL-17在Con A誘導(dǎo)的自身免疫性肝損傷中的作用機制 上述實驗結(jié)果證實,IL-17在Con A誘導(dǎo)的自身免疫性肝損傷模型中起著重要的作用,在這部分中,我們通過檢測IL-17對于Kupffer細胞的作用,對IL-17在Con A誘導(dǎo)的肝損傷模型中的作用機制進行了初步的探討。 首先,我們檢測了模型小鼠肝臟局部的Kupffer細胞的IL-17R的表達情況。結(jié)果顯示,在Con A處理后12小時,Kupffer細胞表達IL-17R較對照組增加。然后,我們分離了模型小鼠肝臟中Kupffer細胞,發(fā)現(xiàn)在體外用IL-17刺激可以明顯增加這些細胞TNF-α和IL-6的釋放。這些結(jié)果提示,IL-17及其受體結(jié)合可以直接促進Kupffer細胞的活化。此外,我們用GdCl3抑制了Kupffer細胞的功能后發(fā)現(xiàn),Con A處理后,小鼠的ALT水平?jīng)]有升高,并且相關(guān)細胞因子TNF-α和IL-6也沒有升高。這些結(jié)果提示IL-17及其受體結(jié)合后可以促進Kupffer細胞分泌TNF-α和IL-6,而它們則直接導(dǎo)致了肝臟損傷。 綜上所訴,本研究闡明了CD4+T和NKT細胞分泌的IL-17在Con A誘導(dǎo)的自身免疫性肝損傷中起著重要的作用。同時,我們還證明了這些T細胞來源的IL-17的病理學(xué)作用主要是通過誘導(dǎo)肝臟局部Kupffer細胞釋放TNF-α和IL-6發(fā)揮作用。因此,我們認為T細胞-IL-17-Kupffer細胞通路是自身免疫性肝炎的新的治療靶點。
【圖文】：

清ALT水平1Zh升高至(1649士95.78)U/L(圖IA)。組織學(xué)檢測結(jié)果顯示:與照組的肝組織比較，ConA注射12h后肝小葉內(nèi)炎癥細胞呈圍管性浸潤、大量潤的單核淋巴細胞在肝組織擴散并導(dǎo)致局部肝細胞壞死(圖IB)。以上結(jié)果表明型誘導(dǎo)成功。

進一步的證明本模型的建立成功，，我們進一步的檢測了TNF一a和IL一6在給與A后的表達水平。我們發(fā)現(xiàn)，ConA誘導(dǎo)后第12小時血清中TNF一a和IL一6的表達平明顯比PBS對照組增高(圖IA)。
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R575.1

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 鄭加嘉;林英;黃清松;吳蔓;;茵梔黃注射液防治Con A誘導(dǎo)小鼠免疫性肝損傷的藥效學(xué)觀察[J];中國藥師;2011年06期

2 張欣;黨雙鎖;;實驗性肝損傷機制研究進展[J];中國肝臟病雜志(電子版);2009年02期

3 姜輝;高家榮;劉新平;韓燕全;;三七總皂苷抗小鼠免疫性肝損傷的研究[J];中藥藥理與臨床;2011年04期

4 桂蜀華;王貴均;熊藝花;賴小平;;狹基線紋香茶菜對免疫性肝損傷小鼠TNF-α mRNA和蛋白表達水平的影響[J];中藥藥理與臨床;2011年04期

5 丁云錄;柳懷玉;李慶杰;陳聲武;;老鸛草提取物對小鼠免疫性肝損傷的保護作用[J];中國新藥雜志;2011年16期

6 張曉園;杭永付;王健;丁選勝;王穎;葉波平;;重組鯊肝刺激物質(zhì)類似物對刀豆蛋白A致小鼠急性肝損傷的保護作用[J];中國藥科大學(xué)學(xué)報;2011年04期

7 李晶;王晶桐;常山幸一;劉玉蘭;;自身免疫性肝損傷與非酒精性脂肪性肝病[J];胃腸病學(xué);2010年09期

8 黃嘯;周植星;段為鋼;江振洲;孫麗新;張陸勇;;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與肝臟損傷的治療[J];現(xiàn)代藥物與臨床;2011年03期

9 鄭宏亮;李振麟;牧人夫;;中藥雞骨草藥理作用研究進展[J];China's Foreign Trade;2011年12期

10 ;[J];;年期

相關(guān)會議論文 前10條

1 陳華棟;朱東升;張錦文;張勇慧;;小鼠免疫性肝損傷模型的研究進展[A];2010年度全國醫(yī)藥學(xué)術(shù)論文交流會暨臨床藥學(xué)與藥學(xué)服務(wù)研究進展培訓(xùn)班論文集[C];2010年

2 劉文蘭;張紅月;車念聰;唐佐青;高連印;;免疫性肝損傷小型豬的舌色改變及血流變化[A];第四次全國中西醫(yī)結(jié)合診斷學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2010年

3 張引強;唐旭東;王鳳云;劉燕玲;卞立群;楊儉勤;趙迎盼;林媚;;榮肝合劑對慢性免疫性肝損傷小鼠的保護作用及機制研究[A];中華中醫(yī)藥學(xué)會第二十二屆全國脾胃病學(xué)術(shù)交流會暨2010年脾胃病診療新進展學(xué)習(xí)班論文匯編[C];2010年

4 李曉冬;李俊;;橙皮苷對小鼠免疫性肝損傷的保護作用及部分作用機制研究[A];轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研討會論文集[C];2010年

5 張引強;唐旭東;王鳳云;劉燕玲;卞立群;楊儉勤;趙迎盼;林媚;;榮肝合劑對慢性免疫性肝損傷小鼠的保護作用[A];第二十二屆全國中西醫(yī)結(jié)合消化系統(tǒng)疾病學(xué)術(shù)會議暨消化疾病診治進展學(xué)習(xí)班論文匯編[C];2010年

6 熊筱娟;白慶云;;烏索酸對豬血清致大鼠慢性免疫性肝損傷的影響[A];中國藥理學(xué)會第十一次全國學(xué)術(shù)會議�？痆C];2011年

7 張引強;唐旭東;王鳳云;劉燕玲;;刀豆蛋白A(Con A)肝損傷模型的研究應(yīng)用[A];第二十二屆全國中西醫(yī)結(jié)合消化系統(tǒng)疾病學(xué)術(shù)會議暨消化疾病診治進展學(xué)習(xí)班論文匯編[C];2010年

8 馬龍;劉濤;丁玉松;馬琪;李濤;姬風(fēng)彩;蘇德奇;;葡萄籽提取物對免疫性肝損傷的保護作用研究[A];第四屆第二次中國毒理學(xué)會食品毒理學(xué)專業(yè)委員會與營養(yǎng)食品所毒理室聯(lián)合召開學(xué)術(shù)會議論文集[C];2008年

9 胡旭東;蔣式驪;劉平;;1,25-二羥基維生素D3防治ConA誘導(dǎo)急性免疫性肝損傷的作用機制研究[A];第十八次全國中西醫(yī)結(jié)合肝病學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2009年

10 高清華;畢靜;范虹;;加味連樸飲抗大鼠免疫性肝損傷的作用機理研究[A];第三屆全國中醫(yī)藥免疫學(xué)術(shù)研討會論文匯編[C];2006年

相關(guān)重要報紙文章 前4條

1 林志彬;靈芝制劑與肝炎[N];人民日報海外版;2004年

2 馮友根;阿魏酸鈉對肝損傷有保護作用[N];中國醫(yī)藥報;2004年

3 廣文;百賽諾投入臨床使用[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2002年

4 李梨平;怎樣對待“有癥狀乙肝帶毒者”？[N];大眾衛(wèi)生報;2004年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 宋雨鴻;丹參多糖抗小鼠免疫性肝損傷及其免疫調(diào)節(jié)機制的研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2010年

2 張引強;中藥榮肝合劑對刀豆蛋白A介導(dǎo)的免疫性肝損傷降酶效應(yīng)的機制研究[D];中國中醫(yī)科學(xué)院;2010年

3 陳杰;IL-33/ST2L通路參與Con A所致小鼠肝損傷的作用及其機制[D];華中科技大學(xué);2012年

4 徐煥賓;CXCL16在免疫性肝損傷中的作用[D];復(fù)旦大學(xué);2005年

5 唐明增;白藜蘆醇抗實驗性肝損傷和抗乙型肝炎病毒的藥效學(xué)研究[D];廣州中醫(yī)藥大學(xué);2005年

6 陳詩慧;加味四逆散抗DHBV 3TC耐藥株和抗炎、抗脂質(zhì)過氧化作用的實驗研究[D];廣州中醫(yī)藥大學(xué);2006年

7 胡潔;人胎兒源間充質(zhì)干細胞的分離鑒定及其在免疫性肝損傷中的免疫雙效作用研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2009年

8 劉道芳;Toll樣受體4介導(dǎo)BCG/LPS誘導(dǎo)免疫性肝損傷的機制及芍藥苷的作用[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2006年

9 孫強玲;人肝臟相關(guān)ConA和DSA結(jié)合型糖蛋白組學(xué)研究[D];復(fù)旦大學(xué);2007年

10 龔權(quán);HMGB1參與實驗性急性肝、肺損傷的作用及其機制[D];華中科技大學(xué);2009年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 閻淑;IL-17在Con A誘導(dǎo)的自身免疫性肝損傷中的作用及其機制研究[D];復(fù)旦大學(xué);2009年

2 李曉冬;橙皮苷對小鼠免疫性肝損傷的保護作用及部分作用機制研究[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2010年

3 劉玉;黃芩苷鋅對大鼠免疫性肝損傷的保護作用及意義[D];昆明醫(yī)學(xué)院;2011年

4 白山嶺;牛黃參膠囊對小鼠免疫性肝損傷保護作用的實驗研究[D];湖北中醫(yī)藥大學(xué);2011年

5 張玲非;白芍總苷在免疫性肝損傷動物體內(nèi)的藥代動力學(xué)研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2011年

6 劉松燦;肝康顆粒對免疫性肝損傷模型小鼠CD_4~+、CD_8~+、IL-12及IFN-γ的影響[D];河南中醫(yī)學(xué)院;2010年

7 姜雪強;二草清肝湯抗大鼠免疫性肝損傷的作用機理研究[D];湖北中醫(yī)學(xué)院;2006年

8 邵芙蓉;芍芪多苷與白芍總苷聯(lián)合黃芪總皂苷對小鼠免疫性肝損傷保護作用的比較[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2007年

9 李響;芍藥苷對小鼠免疫性肝損傷的作用及其部分機制[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2009年

10 陳坤;牛膝對肝臟損傷保護作用的研究[D];揚州大學(xué);2010年

本文編號：2685782