發(fā)布時(shí)間：2020-05-28 20:22

【摘要】：自身免疫性肝炎的發(fā)病率呈上升趨勢(shì),已經(jīng)嚴(yán)重威脅到人類的健康。因此,對(duì)其發(fā)病機(jī)制和防病策略的研究越來(lái)越受到重視。近年來(lái)發(fā)現(xiàn),免疫調(diào)節(jié)機(jī)制在自身免疫性肝炎中起著重要的作用,免疫相關(guān)分子和細(xì)胞與疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。雖然已有一些與免疫相關(guān)的病因解釋,但是目前對(duì)于其發(fā)病的真正的免疫學(xué)機(jī)制尚未深入了解。因此,尋找到與其相關(guān)的免疫學(xué)發(fā)病原因?qū)τ谧陨砻庖咝约膊〉闹委熡兄匾闹笇?dǎo)作用。 Con A誘導(dǎo)的肝炎是急性肝炎的一個(gè)很好的動(dòng)物模型。它模擬了人類自身免疫性肝炎的病理過(guò)程。在Con A誘導(dǎo)的自身免疫性肝炎小鼠體內(nèi),許多細(xì)胞因子升高,包括了(?)TNF-α, IL-6, IFN-γ, and IL-1。其中TNF-α在急性肝臟炎癥的組織損傷中起著重要的作用。在炎癥的早期階段,TNF-α直接導(dǎo)致了肝細(xì)胞損傷。實(shí)驗(yàn)證明,在本模型中,阻斷TNF-α可以有效的保護(hù)小鼠,防止肝損傷的發(fā)生。由單核巨噬細(xì)胞,T細(xì)胞和B細(xì)胞分泌的IL-6具有廣泛的生物學(xué)活性,其在本模型的急性期階段也起著重要的作用。 新近研究發(fā)現(xiàn)：IL-17在自身免疫性肝炎患者的血清中上調(diào)表達(dá),但是IL-17在該病中的作用機(jī)制不清楚。因此,我們的實(shí)驗(yàn)以Con A誘導(dǎo)的自身免疫性肝炎為模型,分析IL-17在Con A誘導(dǎo)的自身免疫性肝炎中的表達(dá),以及IL-17的表達(dá)在Con A誘導(dǎo)的自身免疫性肝炎中的作用,進(jìn)一步分析產(chǎn)生IL-17的細(xì)胞亞群,初步探討IL-17在Con A誘導(dǎo)的自身免疫性肝炎中的作用機(jī)制,以期為自身免疫性肝炎防治提供新的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 第一部分IL-17在Con A誘導(dǎo)的自身免疫性肝損傷中的表達(dá) 我們以高劑量Con A處理小鼠建立自身免疫性肝損傷模型。尾靜脈給予小鼠高劑量的Con A, PBS處理組作為對(duì)照,12小時(shí)后檢測(cè)血清轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和肝病理?yè)p傷的變化。從血清學(xué)指標(biāo)來(lái)看,Con A處理組小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶(ALT)水平較PBS處理組小鼠顯著升高；小鼠肝組織病理檢查結(jié)果顯示,Con A處理組顯示大量浸潤(rùn)的炎性細(xì)胞在肝組織擴(kuò)散并導(dǎo)致局部肝細(xì)胞壞死；PBS處理組沒(méi)有出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。另外,我們檢測(cè)了模型小鼠血清中TNF-α和IL-6的水平,作為導(dǎo)致組織損傷最重要的細(xì)胞因子TNF-α和IL-6在Con A處理組顯著升高。因此通過(guò)以上結(jié)果證明我們成功誘導(dǎo)了肝損傷,建立了Con A誘導(dǎo)的自身免疫性肝損傷模型。 為了了解IL-17在本模型中是否起作用,我們利用TaqMan探針的實(shí)時(shí)熒光定量PCR和ELISA技術(shù)檢測(cè)了IL-17在模型小鼠肝組織中的表達(dá)變化情況,同時(shí)比較了IL-17的表達(dá)水平與肝臟損傷程度的相關(guān)性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,IL-17在Con A誘導(dǎo)的免疫性肝損傷組織中顯著上調(diào)表達(dá),IL-17表達(dá)水平與肝臟損傷程度正相關(guān),提示IL-17表達(dá)與免疫性肝損傷具有一定的相關(guān)性,IL-17的上調(diào)表達(dá)可能參與了免疫性肝損傷的病理發(fā)生。 第二部分IL-17在Con A誘導(dǎo)的自身免疫性肝損傷中的作用 通過(guò)第一部分的實(shí)驗(yàn)證明在Con A誘導(dǎo)的自身免疫性肝損傷小鼠肝臟局部,IL-17增多。在本部分中,我們著重研究IL-17在本模型中所起的作用。首先,我們進(jìn)行了特異性IL-17單克隆抗體的體內(nèi)阻斷實(shí)驗(yàn),觀察肝臟病理變化,檢測(cè)ALT水平、TNF-α和IL-6表達(dá)變化,評(píng)估抗IL-17單克隆抗體對(duì)Con A誘導(dǎo)的自身免疫性肝損傷的影響,初步探討它的可能機(jī)理。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,特異性IL-17單克隆抗體干預(yù)明顯降低了血清ALT水平(p0.05)、改善了肝臟病理?yè)p傷、降低了肝臟組織中促炎癥物質(zhì)如TNF-α和IL-6的表達(dá)水平。這些實(shí)驗(yàn)資料說(shuō)明,抗IL-17單克隆抗體對(duì)Con A誘導(dǎo)的自身免疫性肝損傷具有明顯的保護(hù)作用,IL-17促進(jìn)相關(guān)的炎癥細(xì)胞因子TNF-α和IL-6的釋放可能是導(dǎo)致肝臟損傷的重要機(jī)制之一。其次,為了進(jìn)一步了解內(nèi)源性IL-17在Con A誘導(dǎo)的急性肝損傷中的作用,我們用表達(dá)可溶性的IL-17R:Fc融合蛋白重組腺病毒載體(AdIL-17R:Fc)處理小鼠。這種融合蛋白可以與IL-17R結(jié)合,從而阻斷IL-17的傳導(dǎo)通路。結(jié)果顯示,經(jīng)可溶性的IL-17R：Fc融合蛋白重組腺病毒載體處理后,血清中轉(zhuǎn)氨酶水平明顯降低同時(shí)肝細(xì)胞壞死減輕。同時(shí),與肝損傷水平相平行,可溶性的IL-17R：Fc融合蛋白重組腺病毒載體阻斷IL-17與其受體結(jié)合后,TNF-α和IL-6明顯下降。以上結(jié)果提示,阻斷IL-17信號(hào)通路可以明顯地減輕Con A誘導(dǎo)的急性肝損傷,并且此過(guò)程與阻斷了在本模型中重要的細(xì)胞因子TNF-α和IL-6相關(guān)。 最后,我們構(gòu)建了含有細(xì)胞因子IL-17的真核表達(dá)質(zhì)粒。我們以鈣轉(zhuǎn)法將質(zhì)粒導(dǎo)入Huh7細(xì)胞,獲得含IL-17轉(zhuǎn)染細(xì)胞。將以上轉(zhuǎn)染細(xì)胞的表達(dá)上清濃縮后進(jìn)行ELISA分析可見(jiàn)明顯IL-17表達(dá),證實(shí)以上所構(gòu)建的重組質(zhì)粒能夠在體外進(jìn)行有效表達(dá)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示：該質(zhì)粒注射小鼠后,小鼠體內(nèi)的IL-17明顯升高。以上結(jié)果提示：所有構(gòu)建的重組質(zhì)�？稍隗w內(nèi)外得到有效表達(dá)。尾靜脈高壓注射質(zhì)粒pcDNA3.1-IL-17上調(diào)小鼠體內(nèi)的IL-17,明顯的加重了模型小鼠的肝損傷程度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明,血清ALT較對(duì)照組明顯增高,并且伴有肝臟細(xì)胞壞死面積擴(kuò)大。更重要的是,相關(guān)炎癥細(xì)胞因子TNF-α和IL-6也較對(duì)照組明顯升高。這些數(shù)據(jù)提示,IL-17與Con A誘導(dǎo)的自身免疫性肝炎有著密切的關(guān)系。 第三部分Con A誘導(dǎo)的自身免疫性肝損傷中IL-17的來(lái)源 我們已經(jīng)證明IL-17在Con A誘導(dǎo)的自身免疫性肝炎中起著重要的作用。鑒于以上原因,研究本模型中IL-17的細(xì)胞來(lái)源對(duì)于自身免疫性肝炎的發(fā)病機(jī)制的研究具有重要的意義。我們檢測(cè)了Con A誘導(dǎo)的自身免疫性肝炎模型中肝臟局部的單個(gè)核細(xì)胞分泌IL-17的情況,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,肝臟局部分泌IL-17的細(xì)胞比例較對(duì)照組明顯升高,所以我們認(rèn)為在肝臟損傷中起著作用的IL-17是肝臟局部細(xì)胞分泌的。 鑒于此,我們首先檢測(cè)了Con A誘導(dǎo)的自身免疫性肝損傷中分泌IL-17的T細(xì)胞,我們發(fā)現(xiàn)在模型小鼠的肝臟中分泌的IL-17的T細(xì)胞比例,與前述測(cè)得的其在總細(xì)胞中的比例一致,這提示,肝臟局部分泌IL-17的細(xì)胞主要是T細(xì)胞。因此,我們?cè)赥細(xì)胞的基礎(chǔ)上,由熒光標(biāo)記的抗CD4與抗CD8抗體染色檢測(cè)了不同的T細(xì)胞亞群分泌IL-17的情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,IL-17主要是由CD4+CD8-和CD4-CD8-這兩群T細(xì)胞分泌的,表示這肝臟局部產(chǎn)生IL-17的細(xì)胞來(lái)源存在著通常意義上的Th17細(xì)胞,即分泌IL-17的CD4+T細(xì)胞。但是,這里還存在著一群異于常規(guī)的分泌IL-17的細(xì)胞群,既CD4-CD8-T細(xì)胞亞群。 同時(shí)我們發(fā)現(xiàn),NKT細(xì)胞的數(shù)量和比例在肝臟中Con A處理組較對(duì)照組明顯升高。進(jìn)一步我們檢測(cè)了這些細(xì)胞中IL-17的表達(dá)情況,細(xì)胞內(nèi)染色表明,表達(dá)IL-17的NKT細(xì)胞在Con A處理組較PBS對(duì)照組也明顯升高。這些結(jié)果提示,CD4+T和NKT細(xì)胞是Con A誘導(dǎo)的自身免疫性肝炎中IL-17的主要來(lái)源。 第四部分IL-17在Con A誘導(dǎo)的自身免疫性肝損傷中的作用機(jī)制 上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí),IL-17在Con A誘導(dǎo)的自身免疫性肝損傷模型中起著重要的作用,在這部分中,我們通過(guò)檢測(cè)IL-17對(duì)于Kupffer細(xì)胞的作用,對(duì)IL-17在Con A誘導(dǎo)的肝損傷模型中的作用機(jī)制進(jìn)行了初步的探討。 首先,我們檢測(cè)了模型小鼠肝臟局部的Kupffer細(xì)胞的IL-17R的表達(dá)情況。結(jié)果顯示,在Con A處理后12小時(shí),Kupffer細(xì)胞表達(dá)IL-17R較對(duì)照組增加。然后,我們分離了模型小鼠肝臟中Kupffer細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)在體外用IL-17刺激可以明顯增加這些細(xì)胞TNF-α和IL-6的釋放。這些結(jié)果提示,IL-17及其受體結(jié)合可以直接促進(jìn)Kupffer細(xì)胞的活化。此外,我們用GdCl3抑制了Kupffer細(xì)胞的功能后發(fā)現(xiàn),Con A處理后,小鼠的ALT水平?jīng)]有升高,并且相關(guān)細(xì)胞因子TNF-α和IL-6也沒(méi)有升高。這些結(jié)果提示IL-17及其受體結(jié)合后可以促進(jìn)Kupffer細(xì)胞分泌TNF-α和IL-6,而它們則直接導(dǎo)致了肝臟損傷。 綜上所訴,本研究闡明了CD4+T和NKT細(xì)胞分泌的IL-17在Con A誘導(dǎo)的自身免疫性肝損傷中起著重要的作用。同時(shí),我們還證明了這些T細(xì)胞來(lái)源的IL-17的病理學(xué)作用主要是通過(guò)誘導(dǎo)肝臟局部Kupffer細(xì)胞釋放TNF-α和IL-6發(fā)揮作用。因此,我們認(rèn)為T細(xì)胞-IL-17-Kupffer細(xì)胞通路是自身免疫性肝炎的新的治療靶點(diǎn)。
【圖文】：

清ALT水平1Zh升高至(1649士95.78)U/L(圖IA)。組織學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示:與照組的肝組織比較，ConA注射12h后肝小葉內(nèi)炎癥細(xì)胞呈圍管性浸潤(rùn)、大量潤(rùn)的單核淋巴細(xì)胞在肝組織擴(kuò)散并導(dǎo)致局部肝細(xì)胞壞死(圖IB)。以上結(jié)果表明型誘導(dǎo)成功。

進(jìn)一步的證明本模型的建立成功，，我們進(jìn)一步的檢測(cè)了TNF一a和IL一6在給與A后的表達(dá)水平。我們發(fā)現(xiàn)，ConA誘導(dǎo)后第12小時(shí)血清中TNF一a和IL一6的表達(dá)平明顯比PBS對(duì)照組增高(圖IA)。
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R575.1

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