【摘要】： 臨床上急性胰腺炎分為急性水腫性胰腺炎和急性出血壞死型胰腺炎兩種類型。前者為輕型,臨床癥狀輕,預(yù)后良好；而后者為重型急性胰腺炎,病變以廣泛的胰腺壞死、出血為特征,可累及胰腺周邊組織,并能導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)的失控,損傷重要臟器功能,最終造成多器官功能衰竭。重癥急性胰腺炎病情兇險,死亡率高,是較為棘手的臨床難題。隨著近年來對重癥急性胰腺炎研究的深入,臨床醫(yī)生及科研工作者對對于該病的病理生理、發(fā)生發(fā)展及診斷治療都有了一定的認(rèn)識。SAP的臨床病程分為三期：急性反應(yīng)期、全身感染期和殘余感染期。其中,急性反應(yīng)期出現(xiàn)的過度的炎癥反應(yīng)所導(dǎo)致的全身炎癥反應(yīng)綜合癥及其進一步發(fā)展造成的多器官功能障礙綜合征是主要的死亡原因�？刂圃缙谶^度的炎癥反應(yīng),維持炎癥反應(yīng)平衡是治療SAP的關(guān)鍵。 ω-3多不飽和脂肪酸炎癥調(diào)控作用的發(fā)現(xiàn)為重癥急性胰腺炎的抗炎治療提供了新的思路。目前已有研究對ω-3多不飽和脂肪酸在急性胰腺炎中的作用進行了探索,初步明確了ω-3 PUFAs抗炎作用在重癥急性胰腺條件下同樣存在。然而,這些研究多為描述性研究,并未對ω-3 PUFAs在SAP中抗炎作用的機理進行探討,使得ω-3 PUFAs進一步的臨床應(yīng)用缺乏實驗基礎(chǔ)和指導(dǎo)。 本研究旨在通過體內(nèi)外不同水平的研究,進一步探討ω-3 PUFAs在SAP中抗炎作用,明確其作用的機制,為后續(xù)的臨床研究及應(yīng)用提供實驗依據(jù),使得ω-3 PUFAs在抗炎作用能更好的用于重癥急性胰腺炎的治療。實驗包括以下三部分內(nèi)容： 第一部分：ω-3 PUFAs在大鼠重癥急性胰腺炎模型中的作用及其機制的實驗研究； 第二部分：ω-3 PUFAs在體外胰腺腺泡細(xì)胞培養(yǎng)體系中的炎癥調(diào)控作用及機制； 第三部分：解偶聯(lián)蛋白-2基因表達對重癥急性胰腺炎炎癥調(diào)控作用的實驗研究。 目的：在大鼠重癥胰腺炎動物模型中,探討ω-3 PUFAs的抗炎作用及其潛在的機制。 方法：將60只SD大鼠隨機分為三組：實驗組(EG)、空白對照組(BCG)、陰性對照組(NCG)。實驗組和陰性對照組采用胰膽管低壓逆行注射甘氨脫氧膽酸(GDOC)結(jié)合靜脈持續(xù)給予雨蛙肽的方法建立大鼠重癥急性胰腺炎模型；空白對照組大鼠僅行開腹手術(shù)。建模六個小時后,EG動物由靜脈通道給予由生理鹽水及ω-3PUFAs脂肪乳組成的混合液；NCG組給予普通生理鹽水。持續(xù)輸入24小時后,處死大鼠,留取外周血、胰腺及肺組織標(biāo)本。檢測血清中ALT、AST、amylase、IL-6、IL-10、TNF-α水平；組織切片HE染色行病理檢查；流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血中CD4+T細(xì)胞和CD+8T細(xì)胞的比值；實時定量PCR檢測外周血單個核細(xì)胞中Foxp3、IL-2mRNA表達及胰腺組織中UCP-2 mRNA的表達；Western blot檢測UCP-2在胰腺組織中的蛋白表達；免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測NF-KB的核轉(zhuǎn)位。 結(jié)果：建立胰腺炎模型組(EG和NCG)血清中所測的指標(biāo)均高于空白對照組(BCG)。EG大鼠IL-10濃度高于NCG，而IL-6、TNF-α濃度低于NCG;ALT、ALT、amylase在EG和NCG動物血清中的表達沒有明顯的差異；實驗組外周血中CD4+／CD8+T細(xì)胞比值、Foxp3和IL-2 mRNA表達低于NCG；胰腺組織中UCP-2基因的mRNA和蛋白表達也低于NCG。此外,NCG中的NF-KB表現(xiàn)出更多的活化。 結(jié)論：ω-3 PUFAs能下調(diào)大鼠重癥急性胰腺炎模型中的炎癥反應(yīng),其機制可能包括影響T細(xì)胞功能、抑制NF-KB活化和下調(diào)UCP-2基因的表達。 目的：探討體外胰腺腺泡細(xì)胞培養(yǎng)體系中ω-3 PUFAs對炎癥的調(diào)控作用及機制。 方法：MTT法確定雨蛙肽的最佳刺激濃度后,將體外培養(yǎng)的胰腺腺泡細(xì)胞系A(chǔ)R42J分為A、B、C三組：A組不做特殊處理；B組細(xì)胞用50μmol/的DHA預(yù)處理后加10-8mol/L的雨蛙肽刺激；C組用10-8mol/L的雨蛙肽刺激。實時熒光定量PCR檢測細(xì)胞中TNF-α、IL-6和UCP-2 mRNA的表達；Western blot檢測細(xì)胞核中NF-KBp65亞單位的含量；Hoechest33342/PI原位染色熒光顯微鏡觀察細(xì)胞壞死及凋亡情況。 結(jié)果：使用與雨蛙肽刺激的實驗組細(xì)胞(B組和c組)中TNF-α、IL-6和UCP-2mRNA的表達較A組均明顯增加,而B組的表達水平低于C組(P0.05)；B組細(xì)胞中UCP-2基因的蛋白表達及細(xì)胞核中的NF-KBp65亞單位的含量也低于C組；熒光顯微鏡觀察可見C組較B存在更多的細(xì)胞壞死。 結(jié)論：在體外細(xì)胞培養(yǎng)體系中,ω-3 PUFAs能夠抑制雨蛙肽刺激下胰腺腺泡細(xì)胞炎癥因子的轉(zhuǎn)錄,下調(diào)UCP-2基因的表達,并減少NF-KB的核轉(zhuǎn)位。 目的：研究UCP-2基因表達對炎癥狀態(tài)下胰腺腺泡細(xì)胞死亡方式的影響,探討其作為胰腺炎嚴(yán)重程度重要調(diào)控點的可能性。 方法：針對UCP-2 mRNA設(shè)計3個RNA干擾靶點序列,構(gòu)建并鑒定靶向UCP-2基因的RNA干擾慢病毒載體,篩選出其中最優(yōu)的干擾序列用于實驗。胰腺腺泡細(xì)胞系A(chǔ)R42J分為三組：實驗組細(xì)胞采用RNA干擾慢病毒載體感染,實現(xiàn)對UCP-2基因的特異性敲減；陰性對照組使用空載體轉(zhuǎn)染；空白對照組不做轉(zhuǎn)染。熒光顯微鏡鏡檢確定感染效率,實時聚合酶鏈反應(yīng)鑒定敲減效果。以10-8mol/L的雨蛙肽刺激細(xì)胞,采用Annexin V/PI雙標(biāo)流式細(xì)胞儀檢測刺激后不同時間點細(xì)胞的壞死率和凋亡率；收集細(xì)胞檢測細(xì)胞內(nèi)ATP、ROS水平。 結(jié)果：PCR和測序結(jié)果顯示針對三個靶點的RNA干擾質(zhì)粒均構(gòu)建成功；通過與UCP-2表達質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞及Western blot險測獲得最優(yōu)干擾靶點,并成功包裝成滴度為5×108TU/ml的慢病毒。實驗組細(xì)胞UCP-2基因被有效的敲減,細(xì)胞內(nèi)對應(yīng)時間點的細(xì)胞內(nèi)ROS、ATP的水平以及細(xì)胞凋亡率均顯著高于陰性對照組細(xì)胞,壞死率則顯著低于陰性對照組。 結(jié)論：抑制UCP-2基因表達能影響炎癥狀態(tài)下胰腺腺泡細(xì)胞死亡方式,使細(xì)胞壞死增多而凋亡減少。
【圖文】：

20G20G2072.07士9.45*#69.50士9.00’43.87士7.41264.93士63.31*#259.00土49.36’149.87士103.23amylase(u/6730.13士5366773.73土641524.80士367與Beo相比，’p<0.05;與NeG相比，#p<0.05清細(xì)胞因子濃度白對照組大鼠血清中細(xì)胞因子IL一6、IL一10、TNF一a的濃度低于試實驗組.和陰性對照組大鼠三種細(xì)胞因子的水平明顯升高，且這兩組實驗組大鼠血清斗，促炎因子IL一6、TNF一a的水平要低于陰性對照組，義(p<0.05);klJ抗炎細(xì)胞因子IL一10在實驗組血清中的濃度則高異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)(圖2)。分析結(jié)果，我們認(rèn)為。一3Pu促炎因子，160增加抗炎因子，從而對炎癥反應(yīng)起下調(diào)作用.E范PerimentGrouP

華中科技大學(xué)博士學(xué)位論文性對照組中IL一6、IL一10和TNF一。的水平。與實驗組相比，’p<0.053.組織病理檢查部分胰腺和肺組織病理切片后行HE染色后，空白對照組胰腺及肺的組織結(jié)構(gòu)形態(tài)基本正常，，而建立胰腺炎模型的實驗組和陰性對照組較之空白對照組出現(xiàn)了較多的水腫、壞死和白細(xì)胞浸潤，但實驗組和陰性對照組在形態(tài)學(xué)看，病理損傷程度上并沒有發(fā)現(xiàn)明顯的差異(圖3)。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R576

【參考文獻】

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本文編號：2684008