【摘要】：腸三葉因子對小鼠炎癥性腸病保護作用機制的研究 前言 炎癥性腸病(inflammatory bowel disease,IBD)為一類病因尚未完全明確的累及胃腸道的慢性非特異性炎癥,一般指克羅恩病(Crohn disease,CD)和潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis,UC)。IBD首次發(fā)作可見于任何年齡,但20歲以下潰瘍性結腸炎和克羅恩病患兒占炎癥性腸病總數(shù)的25%-30%。近十幾年的研究發(fā)現(xiàn),IBD在我國的發(fā)病率也逐年增高,約為0.32/100000。因此,IBD在我國也是一種較常見的消化系統(tǒng)疾病。 IBD的腸道炎癥和黏膜組織損傷是其主要特征。炎癥性腸病的病因和發(fā)病機制不明確,目前研究認為IBD是由基因的易感性,環(huán)境因素激發(fā)和腸道免疫系統(tǒng)失調等多種因素交互作用引起的消化系統(tǒng)自身免疫性慢性炎癥疾病。 IBD的免疫學發(fā)病機制被認為是感染、毒素及藥物等作為始動因素破壞腸上皮屏障,使腸組織暴露于大量抗原中,誘發(fā)遺傳易感宿主的粘膜免疫反應。在IBD腸道炎癥和粘膜免疫損傷的發(fā)生發(fā)展中各種炎癥細胞及細胞因子(如TNF-α)、粘附分子、炎癥介質等活性分子起著重要作用,它們參與粘膜炎癥的多種免疫反應,并作為免疫調節(jié)的中心環(huán)節(jié),在IBD中的作用為越來越多的研究所證明。通過特異性阻斷這些炎癥細胞和活性分子的產(chǎn)生、調控以及作用,下調免疫應答的強度,從而控制炎癥、持續(xù)緩解病情已被視為研究熱點。 TLR(Toll-like receptor,TLR)是近年發(fā)現(xiàn)的一種免疫受體,能識別病原微生物及其細胞壁上的一些保守成分——病原相關分子模式(Pathogen-associatedmolecular pattern,PAMP),對腸黏膜天然免疫反應調節(jié)發(fā)揮關鍵作用。IBD患者結腸粘膜上皮細胞及固有層細胞TLR4大量表達,激活下游的細胞因子信號轉導,募集炎性細胞,釋放自由基,損傷黏膜,激發(fā)先天性免疫反應。 炎癥性腸病(IBD)的病理表現(xiàn)在于腸道粘膜糜爛或潰瘍形成,上皮細胞廣泛的缺失和固有層內(nèi)的炎癥細胞浸潤改變。關于IBD病理機制目前雖不完全清楚,但一般認為IBD的發(fā)生與上皮細胞破壞和凋亡加速、炎性細胞凋亡減慢有著密切關系。細胞凋亡失調可以導致自身免疫性疾病的發(fā)生。越來越多的證據(jù)顯示細胞凋亡失調對炎癥性腸病(IBD)的組織損傷和免疫功能紊亂有著重要的影響。 腸三葉因子(ITF)屬于三葉肽家族,是一種新型的生長因子類多肽物質,具有重要的胃腸道黏膜保護和修復作用。實驗證明ITF在維持腸上皮細胞的完整性,恢復腸粘膜的正常通透性方面起到重要作用。但現(xiàn)在很多證據(jù)把TFFs,特別是ITF與免疫調節(jié)聯(lián)系在一起。更有實驗證實ITF可以調節(jié)壞死性小腸結腸炎幼鼠模型的免疫反應。近年來的實驗也證實ITF在調節(jié)細胞凋亡方面也具有一定作用,這意味著ITF在IBD的治療上可能具有更多的價值。但外源性給予基因重組ITF是否可以對IBD模型小鼠起到保護作用?其機制是否與免疫調節(jié)和細胞凋亡干預有關?這些問題的回答也為臨床應用ITF治療IBD提供理論依據(jù)。 實驗材料及方法 一、動物模型及分組 健康6-8周齡雌性BALB/C小鼠,重量20-26克,由中國醫(yī)科大學醫(yī)學實驗動物中心提供。隨機分為3組,每組16只(保證每組小鼠每個時間點取材時8只以上)。根據(jù)灌腸藥物及腹腔注射藥物的不同將BALB/C小鼠分為3組:A組:三硝基苯磺酸(TNBS)組(直腸灌注5%TNBS 0.10ml/只+50%乙醇溶液0.10ml/只+灌腸后第2天起腹腔注射生理鹽水0.1ml/只,連續(xù)5天);B組:腸三葉因子(ITF)組(直腸灌注5%TNBS 0.10ml/只+50%乙醇溶液0.10ml/只+灌腸后第2天起腹腔注射ITF0.1ml/只,連續(xù)5天);C組:乙醇對照組(直腸灌注50%乙醇溶液0.20ml/只+灌腸后第2天起腹腔注射腸生理鹽水0.1ml/只,連續(xù)5天); 灌腸后第7、14天斷頭處死動物,留取脾及結腸標本。實驗過程中死亡動物不列入本研究。 二、實驗標本采集及處理 造模后每天觀察動物一般狀況、糞便情況及稱量體重;在造模后的第7天和第14天收集糞便測定大便隱血分數(shù),進行疾病活動度指數(shù)(DAI)評分。同時給予10%水合氯醛0.3ml/kg腹腔注射麻醉,處死,按以下方法處理和保存標本: 1、留取距肛門4cm左右的結腸組織約0.5cm,分別經(jīng)4%多聚甲醛溶液和2.5%戊二醛溶液固定,分別行H-E染色病理組織學計分、免疫組化、原位末端標記法(TUNEL)凋亡檢測和透射電鏡觀察。 2、取結腸病變部位組織用濾紙吸干水分,稱重,制成組織勻漿,測結腸組織髓過氧化物酶(MPO)活性; 3、留取結腸組織0.5-1cm,置于去RNA酶的Eppendorf管中,經(jīng)液氮后轉至-70℃冰箱,用于進行Real time quantitative RT-PCR、Western blot研究。 4、取結腸組織0.5-1cm,經(jīng)液氮后轉至-70℃冰箱中,用于Western印跡實驗。 5、留取小鼠脾及腸系膜淋巴結淋巴細胞用于流式細胞儀檢測。 三、試驗方法及檢測指標 1、動態(tài)觀察小鼠一般狀態(tài)、體重和排便情況。 2、病理形態(tài)學研究 (1)各組動物于各時間點處死后,剖開腹腔,觀察腸管顏色、有無水腫、出血、擴張、透壁潰瘍及粘連。 (2)光鏡觀察:結腸組織常規(guī)固定后,H-E染色,光鏡下觀察結腸組織形態(tài)學改變。 (3)電鏡觀察:結腸組織固定后,常規(guī)作透射電鏡觀察結腸組織超微結構和腸絨毛的變化。 3、組織化學方法檢測結腸組織MPO的含量。 4、免疫組化法檢測結腸組織TNF-α、TLR4、NF-κBp65蛋白的表達。 5、TUNEL檢測結腸上皮細胞凋亡。 6、Real time quantitive RT-PCR法檢測結腸組織TLR4、NF-κBP65、Bcl-2及Bax mRNA表達。 7、Western Blotting法測定腸組織TLE4和NF-κBP65蛋白表達。 8、流式細胞術檢測脾及腸系膜淋巴結細胞的凋亡情況及Fas、Bcl-2表達。 四、統(tǒng)計學分析 計量資料結果以均值±標準差((?)±S)表示,差異比較用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析,組間比較采用t檢驗法及制作統(tǒng)計圖,P＜0.05提示有顯著性差異。 結果 一、小鼠的一般情況 TNBS組小鼠在灌腸后1天出現(xiàn)精神萎靡、厭食、懶動、體毛凌亂、少光澤、粘液便、肉眼血便等癥狀,化驗便潛血+～++++。嚴重者抽搐、周身涼、甚至死亡。存活者體重于灌腸后第2天下降最明顯,第7天時體重平均下降8.19%,第14天時體重基本接近直腸灌注前;ITF組小鼠出現(xiàn)上述癥狀較TNBS組晚,癥狀輕,第7天時體重平均下降1.74%,第14天時體重基本接近直腸灌注前或略有增加;50%乙醇對照組小鼠活潑,進食好,體重增加明顯,無死亡。 二、小鼠結腸病理學變化 (一)組織肉眼觀察 TNBS組結腸末端病變?yōu)橹?腸道病理改變可涉及全結腸甚至小腸,腸壁和腹膜或大網(wǎng)膜之間粘連;重癥小鼠近肛門4cm內(nèi)出現(xiàn)嚴重的壞死,未見穿孔;第7天癥狀嚴重,第14天好轉。ITF組癥狀較TNBS組輕。50%乙醇對照組結腸周圍解剖結構清楚,腸壁薄且光滑,組織病理學顯示上皮完整,各層結構清晰。 (二)光鏡下病理變化觀察 對照組結腸腺體排列整齊,隱窩、上皮完整,固有層少許淋巴細胞,無炎性細胞浸潤。TNBS灌腸第7天可見粘膜充血、出血、糜爛,粘膜層、粘膜下層中性粒細胞及其它炎性細胞浸潤。病變嚴重小鼠腸壁全層彌漫性充血、出血,非局限性透壁性壞死,腸上皮細胞壞死脫落,甚至全層壞死脫落。損傷部位四周黏膜腺體排列不齊或破壞,杯狀細胞減少、消失,腸壁水腫;ITF組結腸黏膜損傷減輕,炎細胞浸潤減弱,水腫減輕,潰瘍表淺輕微。TNBS造模后14天,與造模后7天相比潰瘍多為局部改變,非透壁性的,炎細胞浸潤程度減輕,水腫存在,杯狀細胞減少或消失,ITF組與TNBS組相比無顯著性差異。 (三)腸組織在電鏡下變化 50%乙醇對照組上皮細胞柱狀,核呈卵圓形,頂部微絨毛排列整齊,細胞間緊密連接完整,內(nèi)質網(wǎng)及線粒體清晰;TNBS/乙醇作用下頂部微絨毛疏松,水腫,微絨毛排列不整、部分斷裂、缺失,部分緊密連接增寬或斷裂。部分柱狀上皮細胞變形、缺失,細胞核固縮,染色質邊聚。粘膜下層有大量炎癥細胞浸潤,線粒體等細胞器空泡變性改變。TNBS/乙醇作用后7天細胞損傷嚴重,至14天細胞損傷有所恢復。ITF作用的腸組織病變輕微。 (四)小鼠DAI記分 TNBS組小鼠在7天、14天平均DAI評分明顯高于50%乙醇對照組小鼠(p＜0.01)。ITF組第7天DAI評分明顯低于TNBS組(p＜0.05);第14天DAI評分,與TNBS組差別非常顯著(p＜0.01)。 三、小鼠結腸組織MPO檢測 造模后7天、14天,TNBS組小鼠結腸MPO活性與50%乙醇對照組相比有顯著增加(p＜0.01)。ITF組MPO含量與TNBS組相比均顯著降低(p＜0.05)。 四、小鼠結腸上皮凋亡的變化 7天TNBS組結腸上皮細胞凋亡陽性細胞較多,主要集中在腸絨毛端,14天有所下降,凋亡指數(shù)明顯高于乙醇對照組(p＜0.01);ITF組凋亡指數(shù)較TNBS組明顯下降,差異顯著,7天(p＜0.01),14天(p＜0.05);對照組則凋亡很少。 五、小鼠脾及腸系膜淋巴結淋巴細胞凋亡及其調控蛋白情況TNBS組、ITF組脾及腸系膜淋巴結淋巴細胞凋亡數(shù)量較乙醇對照組明顯下降,且有統(tǒng)計學意義(p＜0.01),而TNBS組與ITF組之間無顯著性差異。TNBS組在第7天脾及腸系膜淋巴結淋巴細胞中表達Fas的細胞數(shù)量顯著下降,在第14天數(shù)量有所上升,但仍低于對照組,有統(tǒng)計學差異(p＜0.05)。ITF組與TNBS組之間無統(tǒng)計學差異。而表達Bcl-2的細胞數(shù)量則在三組之間無顯著性差異。 六、小鼠結腸組織TNF-α、TLR4和NF-κBp65蛋白的表達變化 (一)免疫組化顯示 7天標本見TNF-α、TLR4、NF-κBp65蛋白在TNBS組、ITF組蛋白表達明顯增強,較乙醇對照組有顯著的差異(p＜0.01),ITF組蛋白表達較TNBS組降低,差異顯著(p＜0.01)。14天標本見TNF-α、TLR4、NF-κBp65蛋白在TNBS組、ITF組蛋白表達明顯增強,較乙醇對照組有顯著的差異(p＜0.05),ITF組蛋白表達較TNBS組降低,差異顯著(p＜0.05)。 (二)Western Blot檢測腸組織TLR4和NF-κBP65蛋白顯示 TLR4蛋白在乙醇組有一定的表達,TNBS組表達明顯增強,ITF組表達明顯弱于TNBS組,差異均顯著(P＜0.01)。NF-κBP65在乙醇組表達較弱,在TNBS組明顯增強,ITF組表達明顯弱于TNBS組,差異顯著(P＜0.01)。 七、小鼠結腸組織TLR4、NF-κBp65、Bcl-2和Bax的分子生物學變化 TNBS組、ITF組與乙醇對照組比較TLR4和NF-κBp65的基因表達水平均有升高,兩者變化趨勢一致;基因水平在第7天即有升高,到第14天有所恢復,但較對照組仍有顯著差異(p＜0.01)。在第7天、14天ITF組的TLR4和NF-κBp65基因表達均較TNBS組有所下調,差異顯著(p＜0.01)。 TNBS組、ITF組與乙醇對照組比較Bcl-2的基因表達水平均有降低,而Bax的基因表達水平均有升高,兩者變化趨勢相反;Bcl-2基因水平在第7天下降明顯,到第14天有所恢復,但較對照組仍有顯著差異(p＜0.01)。Bax基因水平在第7天即有升高,到第14天有所恢復,但較對照組仍有顯著差異(p＜0.01)。在第7天、14天ITF組的Bcl-2基因表達均較TNBS組有所升高,差異顯著(p＜0.01);而Bax基因表達均較TNBS組有所下降,差異顯著(p＜0.01)。 結論 1、ITF可以減輕TNBS誘導的小鼠炎癥性腸病腸粘膜炎癥病理損傷并能促進損傷的修復。 2、針對由TNBS誘導的小鼠炎癥性腸病腹腔注射ITF是一個方便而且有效的實驗研究方法。 3、TNBS誘導的IBD小鼠結腸粘膜組織中TLR4/NF-κBp65的mRNA及蛋白表達上調,TNF-α高表達。 4、腹腔注射ITF對小鼠炎癥性腸病結腸組織損傷的保護作用機制之一可能是與下調結腸粘膜組織中TLR4/NF-κBp65的mRNA及蛋白表達量而降低TNF-α的表達有關。 5、TNBS誘導的IBD小鼠結腸粘膜上皮存在凋亡過度,可能與Bcl-2 mRNA表達下調,Bax mRNA表達上調,Bcl-2/Bax的比值下降有關。 6、ITF具有下調TNBS誘導的IBD小鼠結腸粘膜上皮凋亡的作用,可能是通過上調Bcl-2 mRNA表達,下調Bax mRNA表達,增加Bcl-2/Bax的比值實現(xiàn)的。 7、INBS誘導的IBD小鼠脾淋巴細胞和腸系膜淋巴結淋巴細胞存在凋亡不足,可能與Fas/FasL信號傳導通路有關。 8、ITF對TNBS誘導的IBD小鼠脾淋巴細胞和腸系膜淋巴結淋巴細胞的凋亡可能無調節(jié)作用。
【圖文】：

rrF組表達明顯弱于TNBS組，差異均顯著(P<0.01)。NF一忍P65在乙醇組表達較弱，在TNBS組明顯增強，，ITF組表達明顯弱于TNBS組，差異顯著(p<0.01)(見表2.4，2.5;圖2.4，2.5;圖片2.8)。表2.4，腸組織TLR4蛋白相對表達量區(qū)士S，n=8)TNBS組ITF組乙醇對照組7天14天 0.9531士0.0686 0.6829士0.09861“b 0.6399士0.057lab 0.5651士0.0286 0.7799士0.0754 0.5433士0.0344a與乙醇組相比P<0.01b與TNBS組相比P<0.01表2.5，腸組織NF一沼P65蛋白相對表達量區(qū)士S，n=8)TNBS組ITF組乙醇對照組7天14天 0.7209士 0.04370.5974士0.1109“b 0.5208士0

乙醇組圖3.2，AnnexinV一FITC用I雙標記流二、單標記流式細胞儀檢測脾及蛋白情況從表3.3可以看出TNBS組在第7天數(shù)量顯著下降，在第14天數(shù)量有所上升，但ITF組與TNBS組之間無統(tǒng)計學差異。而表著性差異(見表3.3一3.6;圖3.3一3.6)。表3.3，小鼠炎癥性腸病脾淋巴細胞TNBS組7天14天 3.70肚0.784 5.530士0.742
【學位授予單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R574

【參考文獻】

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本文編號：2681862