發(fā)布時(shí)間：2020-05-26 12:50

【摘要】：腸三葉因子對(duì)小鼠炎癥性腸病保護(hù)作用機(jī)制的研究 前言 炎癥性腸病(inflammatory bowel disease,IBD)為一類(lèi)病因尚未完全明確的累及胃腸道的慢性非特異性炎癥,一般指克羅恩病(Crohn disease,CD)和潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)。IBD首次發(fā)作可見(jiàn)于任何年齡,但20歲以下潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩病患兒占炎癥性腸病總數(shù)的25%-30%。近十幾年的研究發(fā)現(xiàn),IBD在我國(guó)的發(fā)病率也逐年增高,約為0.32/100000。因此,IBD在我國(guó)也是一種較常見(jiàn)的消化系統(tǒng)疾病。 IBD的腸道炎癥和黏膜組織損傷是其主要特征。炎癥性腸病的病因和發(fā)病機(jī)制不明確,目前研究認(rèn)為IBD是由基因的易感性,環(huán)境因素激發(fā)和腸道免疫系統(tǒng)失調(diào)等多種因素交互作用引起的消化系統(tǒng)自身免疫性慢性炎癥疾病。 IBD的免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制被認(rèn)為是感染、毒素及藥物等作為始動(dòng)因素破壞腸上皮屏障,使腸組織暴露于大量抗原中,誘發(fā)遺傳易感宿主的粘膜免疫反應(yīng)。在IBD腸道炎癥和粘膜免疫損傷的發(fā)生發(fā)展中各種炎癥細(xì)胞及細(xì)胞因子(如TNF-α)、粘附分子、炎癥介質(zhì)等活性分子起著重要作用,它們參與粘膜炎癥的多種免疫反應(yīng),并作為免疫調(diào)節(jié)的中心環(huán)節(jié),在IBD中的作用為越來(lái)越多的研究所證明。通過(guò)特異性阻斷這些炎癥細(xì)胞和活性分子的產(chǎn)生、調(diào)控以及作用,下調(diào)免疫應(yīng)答的強(qiáng)度,從而控制炎癥、持續(xù)緩解病情已被視為研究熱點(diǎn)。 TLR(Toll-like receptor,TLR)是近年發(fā)現(xiàn)的一種免疫受體,能識(shí)別病原微生物及其細(xì)胞壁上的一些保守成分——病原相關(guān)分子模式(Pathogen-associatedmolecular pattern,PAMP),對(duì)腸黏膜天然免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)發(fā)揮關(guān)鍵作用。IBD患者結(jié)腸粘膜上皮細(xì)胞及固有層細(xì)胞TLR4大量表達(dá),激活下游的細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),募集炎性細(xì)胞,釋放自由基,損傷黏膜,激發(fā)先天性免疫反應(yīng)。 炎癥性腸病(IBD)的病理表現(xiàn)在于腸道粘膜糜爛或潰瘍形成,上皮細(xì)胞廣泛的缺失和固有層內(nèi)的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)改變。關(guān)于IBD病理機(jī)制目前雖不完全清楚,但一般認(rèn)為IBD的發(fā)生與上皮細(xì)胞破壞和凋亡加速、炎性細(xì)胞凋亡減慢有著密切關(guān)系。細(xì)胞凋亡失調(diào)可以導(dǎo)致自身免疫性疾病的發(fā)生。越來(lái)越多的證據(jù)顯示細(xì)胞凋亡失調(diào)對(duì)炎癥性腸病(IBD)的組織損傷和免疫功能紊亂有著重要的影響。 腸三葉因子(ITF)屬于三葉肽家族,是一種新型的生長(zhǎng)因子類(lèi)多肽物質(zhì),具有重要的胃腸道黏膜保護(hù)和修復(fù)作用。實(shí)驗(yàn)證明ITF在維持腸上皮細(xì)胞的完整性,恢復(fù)腸粘膜的正常通透性方面起到重要作用。但現(xiàn)在很多證據(jù)把TFFs,特別是ITF與免疫調(diào)節(jié)聯(lián)系在一起。更有實(shí)驗(yàn)證實(shí)ITF可以調(diào)節(jié)壞死性小腸結(jié)腸炎幼鼠模型的免疫反應(yīng)。近年來(lái)的實(shí)驗(yàn)也證實(shí)ITF在調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡方面也具有一定作用,這意味著ITF在IBD的治療上可能具有更多的價(jià)值。但外源性給予基因重組ITF是否可以對(duì)IBD模型小鼠起到保護(hù)作用?其機(jī)制是否與免疫調(diào)節(jié)和細(xì)胞凋亡干預(yù)有關(guān)?這些問(wèn)題的回答也為臨床應(yīng)用ITF治療IBD提供理論依據(jù)。 實(shí)驗(yàn)材料及方法 一、動(dòng)物模型及分組 健康6-8周齡雌性BALB/C小鼠,重量20-26克,由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分為3組,每組16只(保證每組小鼠每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取材時(shí)8只以上)。根據(jù)灌腸藥物及腹腔注射藥物的不同將BALB/C小鼠分為3組:A組:三硝基苯磺酸(TNBS)組(直腸灌注5%TNBS 0.10ml/只+50%乙醇溶液0.10ml/只+灌腸后第2天起腹腔注射生理鹽水0.1ml/只,連續(xù)5天);B組:腸三葉因子(ITF)組(直腸灌注5%TNBS 0.10ml/只+50%乙醇溶液0.10ml/只+灌腸后第2天起腹腔注射ITF0.1ml/只,連續(xù)5天);C組:乙醇對(duì)照組(直腸灌注50%乙醇溶液0.20ml/只+灌腸后第2天起腹腔注射腸生理鹽水0.1ml/只,連續(xù)5天); 灌腸后第7、14天斷頭處死動(dòng)物,留取脾及結(jié)腸標(biāo)本。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中死亡動(dòng)物不列入本研究。 二、實(shí)驗(yàn)標(biāo)本采集及處理 造模后每天觀察動(dòng)物一般狀況、糞便情況及稱(chēng)量體重;在造模后的第7天和第14天收集糞便測(cè)定大便隱血分?jǐn)?shù),進(jìn)行疾病活動(dòng)度指數(shù)(DAI)評(píng)分。同時(shí)給予10%水合氯醛0.3ml/kg腹腔注射麻醉,處死,按以下方法處理和保存標(biāo)本: 1、留取距肛門(mén)4cm左右的結(jié)腸組織約0.5cm,分別經(jīng)4%多聚甲醛溶液和2.5%戊二醛溶液固定,分別行H-E染色病理組織學(xué)計(jì)分、免疫組化、原位末端標(biāo)記法(TUNEL)凋亡檢測(cè)和透射電鏡觀察。 2、取結(jié)腸病變部位組織用濾紙吸干水分,稱(chēng)重,制成組織勻漿,測(cè)結(jié)腸組織髓過(guò)氧化物酶(MPO)活性; 3、留取結(jié)腸組織0.5-1cm,置于去RNA酶的Eppendorf管中,經(jīng)液氮后轉(zhuǎn)至-70℃冰箱,用于進(jìn)行Real time quantitative RT-PCR、Western blot研究。 4、取結(jié)腸組織0.5-1cm,經(jīng)液氮后轉(zhuǎn)至-70℃冰箱中,用于Western印跡實(shí)驗(yàn)。 5、留取小鼠脾及腸系膜淋巴結(jié)淋巴細(xì)胞用于流式細(xì)胞儀檢測(cè)。 三、試驗(yàn)方法及檢測(cè)指標(biāo) 1、動(dòng)態(tài)觀察小鼠一般狀態(tài)、體重和排便情況。 2、病理形態(tài)學(xué)研究 (1)各組動(dòng)物于各時(shí)間點(diǎn)處死后,剖開(kāi)腹腔,觀察腸管顏色、有無(wú)水腫、出血、擴(kuò)張、透壁潰瘍及粘連。 (2)光鏡觀察:結(jié)腸組織常規(guī)固定后,H-E染色,光鏡下觀察結(jié)腸組織形態(tài)學(xué)改變。 (3)電鏡觀察:結(jié)腸組織固定后,常規(guī)作透射電鏡觀察結(jié)腸組織超微結(jié)構(gòu)和腸絨毛的變化。 3、組織化學(xué)方法檢測(cè)結(jié)腸組織MPO的含量。 4、免疫組化法檢測(cè)結(jié)腸組織TNF-α、TLR4、NF-κBp65蛋白的表達(dá)。 5、TUNEL檢測(cè)結(jié)腸上皮細(xì)胞凋亡。 6、Real time quantitive RT-PCR法檢測(cè)結(jié)腸組織TLR4、NF-κBP65、Bcl-2及Bax mRNA表達(dá)。 7、Western Blotting法測(cè)定腸組織TLE4和NF-κBP65蛋白表達(dá)。 8、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)脾及腸系膜淋巴結(jié)細(xì)胞的凋亡情況及Fas、Bcl-2表達(dá)。 四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 計(jì)量資料結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差((?)±S)表示,差異比較用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,組間比較采用t檢驗(yàn)法及制作統(tǒng)計(jì)圖,P＜0.05提示有顯著性差異。 結(jié)果 一、小鼠的一般情況 TNBS組小鼠在灌腸后1天出現(xiàn)精神萎靡、厭食、懶動(dòng)、體毛凌亂、少光澤、粘液便、肉眼血便等癥狀,化驗(yàn)便潛血+～++++。嚴(yán)重者抽搐、周身涼、甚至死亡。存活者體重于灌腸后第2天下降最明顯,第7天時(shí)體重平均下降8.19%,第14天時(shí)體重基本接近直腸灌注前;ITF組小鼠出現(xiàn)上述癥狀較TNBS組晚,癥狀輕,第7天時(shí)體重平均下降1.74%,第14天時(shí)體重基本接近直腸灌注前或略有增加;50%乙醇對(duì)照組小鼠活潑,進(jìn)食好,體重增加明顯,無(wú)死亡。 二、小鼠結(jié)腸病理學(xué)變化 (一)組織肉眼觀察 TNBS組結(jié)腸末端病變?yōu)橹?腸道病理改變可涉及全結(jié)腸甚至小腸,腸壁和腹膜或大網(wǎng)膜之間粘連;重癥小鼠近肛門(mén)4cm內(nèi)出現(xiàn)嚴(yán)重的壞死,未見(jiàn)穿孔;第7天癥狀嚴(yán)重,第14天好轉(zhuǎn)。ITF組癥狀較TNBS組輕。50%乙醇對(duì)照組結(jié)腸周?chē)馄式Y(jié)構(gòu)清楚,腸壁薄且光滑,組織病理學(xué)顯示上皮完整,各層結(jié)構(gòu)清晰。 (二)光鏡下病理變化觀察 對(duì)照組結(jié)腸腺體排列整齊,隱窩、上皮完整,固有層少許淋巴細(xì)胞,無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。TNBS灌腸第7天可見(jiàn)粘膜充血、出血、糜爛,粘膜層、粘膜下層中性粒細(xì)胞及其它炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。病變嚴(yán)重小鼠腸壁全層彌漫性充血、出血,非局限性透壁性壞死,腸上皮細(xì)胞壞死脫落,甚至全層壞死脫落。損傷部位四周黏膜腺體排列不齊或破壞,杯狀細(xì)胞減少、消失,腸壁水腫;ITF組結(jié)腸黏膜損傷減輕,炎細(xì)胞浸潤(rùn)減弱,水腫減輕,潰瘍表淺輕微。TNBS造模后14天,與造模后7天相比潰瘍多為局部改變,非透壁性的,炎細(xì)胞浸潤(rùn)程度減輕,水腫存在,杯狀細(xì)胞減少或消失,ITF組與TNBS組相比無(wú)顯著性差異。 (三)腸組織在電鏡下變化 50%乙醇對(duì)照組上皮細(xì)胞柱狀,核呈卵圓形,頂部微絨毛排列整齊,細(xì)胞間緊密連接完整,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及線(xiàn)粒體清晰;TNBS/乙醇作用下頂部微絨毛疏松,水腫,微絨毛排列不整、部分?jǐn)嗔�、缺�?部分緊密連接增寬或斷裂。部分柱狀上皮細(xì)胞變形、缺失,細(xì)胞核固縮,染色質(zhì)邊聚。粘膜下層有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),線(xiàn)粒體等細(xì)胞器空泡變性改變。TNBS/乙醇作用后7天細(xì)胞損傷嚴(yán)重,至14天細(xì)胞損傷有所恢復(fù)。ITF作用的腸組織病變輕微。 (四)小鼠DAI記分 TNBS組小鼠在7天、14天平均DAI評(píng)分明顯高于50%乙醇對(duì)照組小鼠(p＜0.01)。ITF組第7天DAI評(píng)分明顯低于TNBS組(p＜0.05);第14天DAI評(píng)分,與TNBS組差別非常顯著(p＜0.01)。 三、小鼠結(jié)腸組織MPO檢測(cè) 造模后7天、14天,TNBS組小鼠結(jié)腸MPO活性與50%乙醇對(duì)照組相比有顯著增加(p＜0.01)。ITF組MPO含量與TNBS組相比均顯著降低(p＜0.05)。 四、小鼠結(jié)腸上皮凋亡的變化 7天TNBS組結(jié)腸上皮細(xì)胞凋亡陽(yáng)性細(xì)胞較多,主要集中在腸絨毛端,14天有所下降,凋亡指數(shù)明顯高于乙醇對(duì)照組(p＜0.01);ITF組凋亡指數(shù)較TNBS組明顯下降,差異顯著,7天(p＜0.01),14天(p＜0.05);對(duì)照組則凋亡很少。 五、小鼠脾及腸系膜淋巴結(jié)淋巴細(xì)胞凋亡及其調(diào)控蛋白情況TNBS組、ITF組脾及腸系膜淋巴結(jié)淋巴細(xì)胞凋亡數(shù)量較乙醇對(duì)照組明顯下降,且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01),而TNBS組與ITF組之間無(wú)顯著性差異。TNBS組在第7天脾及腸系膜淋巴結(jié)淋巴細(xì)胞中表達(dá)Fas的細(xì)胞數(shù)量顯著下降,在第14天數(shù)量有所上升,但仍低于對(duì)照組,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05)。ITF組與TNBS組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。而表達(dá)Bcl-2的細(xì)胞數(shù)量則在三組之間無(wú)顯著性差異。 六、小鼠結(jié)腸組織TNF-α、TLR4和NF-κBp65蛋白的表達(dá)變化 (一)免疫組化顯示 7天標(biāo)本見(jiàn)TNF-α、TLR4、NF-κBp65蛋白在TNBS組、ITF組蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng),較乙醇對(duì)照組有顯著的差異(p＜0.01),ITF組蛋白表達(dá)較TNBS組降低,差異顯著(p＜0.01)。14天標(biāo)本見(jiàn)TNF-α、TLR4、NF-κBp65蛋白在TNBS組、ITF組蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng),較乙醇對(duì)照組有顯著的差異(p＜0.05),ITF組蛋白表達(dá)較TNBS組降低,差異顯著(p＜0.05)。 (二)Western Blot檢測(cè)腸組織TLR4和NF-κBP65蛋白顯示 TLR4蛋白在乙醇組有一定的表達(dá),TNBS組表達(dá)明顯增強(qiáng),ITF組表達(dá)明顯弱于TNBS組,差異均顯著(P＜0.01)。NF-κBP65在乙醇組表達(dá)較弱,在TNBS組明顯增強(qiáng),ITF組表達(dá)明顯弱于TNBS組,差異顯著(P＜0.01)。 七、小鼠結(jié)腸組織TLR4、NF-κBp65、Bcl-2和Bax的分子生物學(xué)變化 TNBS組、ITF組與乙醇對(duì)照組比較TLR4和NF-κBp65的基因表達(dá)水平均有升高,兩者變化趨勢(shì)一致;基因水平在第7天即有升高,到第14天有所恢復(fù),但較對(duì)照組仍有顯著差異(p＜0.01)。在第7天、14天ITF組的TLR4和NF-κBp65基因表達(dá)均較TNBS組有所下調(diào),差異顯著(p＜0.01)。 TNBS組、ITF組與乙醇對(duì)照組比較Bcl-2的基因表達(dá)水平均有降低,而B(niǎo)ax的基因表達(dá)水平均有升高,兩者變化趨勢(shì)相反;Bcl-2基因水平在第7天下降明顯,到第14天有所恢復(fù),但較對(duì)照組仍有顯著差異(p＜0.01)。Bax基因水平在第7天即有升高,到第14天有所恢復(fù),但較對(duì)照組仍有顯著差異(p＜0.01)。在第7天、14天ITF組的Bcl-2基因表達(dá)均較TNBS組有所升高,差異顯著(p＜0.01);而B(niǎo)ax基因表達(dá)均較TNBS組有所下降,差異顯著(p＜0.01)。 結(jié)論 1、ITF可以減輕TNBS誘導(dǎo)的小鼠炎癥性腸病腸粘膜炎癥病理?yè)p傷并能促進(jìn)損傷的修復(fù)。 2、針對(duì)由TNBS誘導(dǎo)的小鼠炎癥性腸病腹腔注射ITF是一個(gè)方便而且有效的實(shí)驗(yàn)研究方法。 3、TNBS誘導(dǎo)的IBD小鼠結(jié)腸粘膜組織中TLR4/NF-κBp65的mRNA及蛋白表達(dá)上調(diào),TNF-α高表達(dá)。 4、腹腔注射ITF對(duì)小鼠炎癥性腸病結(jié)腸組織損傷的保護(hù)作用機(jī)制之一可能是與下調(diào)結(jié)腸粘膜組織中TLR4/NF-κBp65的mRNA及蛋白表達(dá)量而降低TNF-α的表達(dá)有關(guān)。 5、TNBS誘導(dǎo)的IBD小鼠結(jié)腸粘膜上皮存在凋亡過(guò)度,可能與Bcl-2 mRNA表達(dá)下調(diào),Bax mRNA表達(dá)上調(diào),Bcl-2/Bax的比值下降有關(guān)。 6、ITF具有下調(diào)TNBS誘導(dǎo)的IBD小鼠結(jié)腸粘膜上皮凋亡的作用,可能是通過(guò)上調(diào)Bcl-2 mRNA表達(dá),下調(diào)Bax mRNA表達(dá),增加Bcl-2/Bax的比值實(shí)現(xiàn)的。 7、INBS誘導(dǎo)的IBD小鼠脾淋巴細(xì)胞和腸系膜淋巴結(jié)淋巴細(xì)胞存在凋亡不足,可能與Fas/FasL信號(hào)傳導(dǎo)通路有關(guān)。 8、ITF對(duì)TNBS誘導(dǎo)的IBD小鼠脾淋巴細(xì)胞和腸系膜淋巴結(jié)淋巴細(xì)胞的凋亡可能無(wú)調(diào)節(jié)作用。
【圖文】：

rrF組表達(dá)明顯弱于TNBS組，差異均顯著(P<0.01)。NF一忍P65在乙醇組表達(dá)較弱，在TNBS組明顯增強(qiáng)，，ITF組表達(dá)明顯弱于TNBS組，差異顯著(p<0.01)(見(jiàn)表2.4，2.5;圖2.4，2.5;圖片2.8)。表2.4，腸組織TLR4蛋白相對(duì)表達(dá)量區(qū)士S，n=8)TNBS組ITF組乙醇對(duì)照組7天14天 0.9531士0.0686 0.6829士0.09861“b 0.6399士0.057lab 0.5651士0.0286 0.7799士0.0754 0.5433士0.0344a與乙醇組相比P<0.01b與TNBS組相比P<0.01表2.5，腸組織NF一沼P65蛋白相對(duì)表達(dá)量區(qū)士S，n=8)TNBS組ITF組乙醇對(duì)照組7天14天 0.7209士 0.04370.5974士0.1109“b 0.5208士0

乙醇組圖3.2，AnnexinV一FITC用I雙標(biāo)記流二、單標(biāo)記流式細(xì)胞儀檢測(cè)脾及蛋白情況從表3.3可以看出TNBS組在第7天數(shù)量顯著下降，在第14天數(shù)量有所上升，但I(xiàn)TF組與TNBS組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。而表著性差異(見(jiàn)表3.3一3.6;圖3.3一3.6)。表3.3，小鼠炎癥性腸病脾淋巴細(xì)胞TNBS組7天14天 3.70肚0.784 5.530士0.742
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類(lèi)號(hào)】：R574

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2681862