【摘要】：目的1.通過(guò)高脂飲食(HFD)和蛋氨酸-膽堿缺乏飲食(MCD)建立非酒精性脂肪性肝炎(Non-alcoholic steatohepatitis,NASH)小鼠模型,通過(guò) 16s rRNA基因測(cè)序檢測(cè)兩種NASH模型小鼠腸粘膜菌群的改變。2.檢測(cè)評(píng)估兩種模型小鼠腸粘膜屏障的損傷并分析與腸粘膜菌群紊亂之間的相關(guān)性。方法1.構(gòu)建小鼠NASH模型:分別通過(guò)HFD和MCD建立小鼠NASH模型。處死小鼠后留取相應(yīng)標(biāo)本。2.應(yīng)用蘇木精-伊紅(Hematoxylinand eosin,HE)染色和油紅(Oil red)O染色觀(guān)察肝組織病理學(xué)的改變。3.檢測(cè)血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Alanine aminotransferase,ALT)、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Aspartate aminotransferase,AST)、二胺氧化酶(Diamine oxidase,DAO)、D-乳酸及細(xì)菌內(nèi)毒素濃度。4.應(yīng)用HE染色觀(guān)察結(jié)腸粘膜病理學(xué)改變。應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色法(immunohistochemistry,IHC)觀(guān)察緊密連接蛋白o(hù)ccludin的表達(dá)與分布。5.采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)腸巨噬細(xì)胞(macrophage,M(?))及髓源抑制性細(xì)胞(myeloid-derived suppressor cells,MDSCs)的數(shù)量變化情況。6.應(yīng)用16s rRNA基因測(cè)序檢測(cè)并分析各組小鼠結(jié)腸粘膜菌群的變化情況。結(jié)果1.成功構(gòu)建兩種小鼠NASH模型:與ND組相比,HFD組的體重、肝重、肝指數(shù)、ALT及AST均增加(P0.05);同樣,MCD組的ALT及AST也比CON組明顯升高(P0.05)。肝臟HE染色及油紅O染色顯示對(duì)照組肝組織著色均勻,肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整,未見(jiàn)脂滴以及炎性細(xì)胞浸潤(rùn),而HFD組和MCD組的肝臟都出現(xiàn)明顯的肝細(xì)胞脂肪變性與炎癥反應(yīng)。上述結(jié)果顯示兩種小鼠NASH模型成功建立。2.NASH小鼠腸粘膜屏障功能損傷:與對(duì)照組相比,HFD組和MCD組的結(jié)腸組織絨毛排列疏松紊亂,部分絨毛出現(xiàn)萎縮、缺損、斷裂,甚至出現(xiàn)上皮層與固有層分離。模型組occludin蛋白較對(duì)照組表達(dá)降低,分布異常。進(jìn)一步流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明,模型組的腸粘膜中M(?)與MDSCs數(shù)量均較對(duì)照組明顯增多(P0.001)。同時(shí),HFD組和MCD組的DAO、D-乳酸及細(xì)菌內(nèi)毒素也均較對(duì)照組明顯升高(P0.05)。3.腸粘膜菌群紊亂:在菌群門(mén)水平,HFD組較ND組變形菌門(mén)增多(P=0.08),放線(xiàn)菌門(mén)和疣微菌門(mén)減少(P0.05)。MCD組較CON組增多的菌群有脫鐵桿菌門(mén)(P0.05),減少的菌群有擬桿菌門(mén)及疣微菌門(mén)(P0.05)。HFD組和MCD組共同減少的菌群是疣微菌門(mén)。根據(jù)兩種模型共同增加或減少的菌群,我們發(fā)現(xiàn)Akkermansia菌屬在兩種模型中都是明顯減少的(P0.05),該菌屬于疣微菌門(mén)。4.腸粘膜屏障指標(biāo)與Akkermansia菌屬豐度相關(guān)性分析:HFD組的DAO(r=-0.879,P0.05)、D-乳酸(r=-0.898,P0.05)及細(xì)菌內(nèi)毒素(r=-0.936,P0.05)分別與Akkermansia豐度呈負(fù)相關(guān)。同樣的,MCD組的DAO(r=-0.957,P0.05)、D-乳酸(r=-0.891,P0.05)及細(xì)菌內(nèi)毒素(r=-0.880,P0.05)也分別與Akkermansia的豐度呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。結(jié)論1.兩種模型均可見(jiàn)到機(jī)械屏障受損,腸粘膜損傷,腸絨毛變短、稀疏,緊密連接蛋白o(hù)ccludin表達(dá)下降,通透性增加,內(nèi)毒素移位,腸粘膜免疫屏障功能被激活,出現(xiàn)M(?)和MDSCs數(shù)量增多。腸粘膜屏障損傷可能是NASH發(fā)生發(fā)展的重要原因。2.兩種模型都出現(xiàn)腸粘膜菌群失調(diào),Akkermansia豐度在兩種模型中都是減少的,另外在兩種模型中Akkermansia豐度分別與DAO、D-乳酸及細(xì)菌內(nèi)毒素呈負(fù)相關(guān),說(shuō)明該菌的減少可能會(huì)加重腸粘膜屏障的損傷。
【圖文】：

體重增長(zhǎng)平緩。ＨＦＤ組小鼠體重增長(zhǎng)更快，８周后毛發(fā)變得紊亂無(wú)光澤，逡逑精神變差，活動(dòng)量減少。１２周后處死時(shí)的體重（３４．６邋土邋０．７）較ＮＤ組（３１．１６邋±邋０．８５）逡逑明顯增加（Ｐ＜０．０１，圖１Ｂ）。ＭＣＤ組小鼠的體重在２周內(nèi)快速下降，２周后局逡逑部出現(xiàn)毛發(fā)脫落，易怒，喜爭(zhēng)斗。３０天后處死時(shí)的體重（１５．２９±邋０．３６）較ＣＯＮ逡逑組（２５．６１±０．８９）明顯減少（ＰＣ０．００１，圖邋ＩＤ）。逡逑Ａ邋ｎｏ邐Ｂ邋４0－｜邐＇逡逑４０＾邋X(qián)4＊邋ＨＦ０邐—｜—逡逑蕓邋３５＿邐ｆ邐丨逡逑２0ｆ－ｉ邋－ｒ邋ｒ－ｉ邋？邋ｉ邋ｉ邋？邋ｉ邋？邋ｉ邋）邐９ＨＢ逡逑０１２３４５６７８９邋１０ｔ１１２邐＾邐邐＇邐邐邋１邐邐逡逑Ｗｏ？ｋｓ邋ａｆｔｅｒ邋ＨＦＤ邐令邐々逡逑Ｃ邐Ｄ逡逑？ＣＯＮ邐■￣￣—￣￣．逡逑＋邋ＭＣＤ邐丁逡逑ｉ：ｎ＿逡逑０邐３邐？邐？邋ｔ２邋ｔｓ邐１｜邋２１邋２４邋２；邋Ｍ邐＾邐Ｏ逡逑Ｄａｙｓ邋ＭＣＤ邐ｃＰ逡逑圖１各組小鼠體重的變化（＊＊Ｐ＜0．0ｌ，邋＊＊＊Ｐ＜0．00ｌ）逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１邋Ｃｈａｎｇｅｓ邋ｉｎ邋ｂｏｄｙ邋ｗｅｉｇｈｔ邋ｏｆ邋ｍｉｃｅ邋ｉｎ邋ｅａｃｈ邋ｇｒｏｕｐ邋（＊＊Ｐ＜０．０１？邋＊＊＊Ｐ＜邋０．００１）逡逑２小鼠的肝臟形態(tài)、肝重、肝指數(shù)比較逡逑ＮＤ組和ＣＯＮ組的肝臟顏色紅潤(rùn)，形態(tài)飽滿(mǎn)，邊緣銳利。ＨＦＤ組小鼠肝臟逡逑腫大，顏色變黃，表面可見(jiàn)結(jié)節(jié)。ＭＣＤ組小鼠肝臟萎縮，顏色變黃，表面出現(xiàn)逡逑大量結(jié)節(jié)。（圖２Ａ－Ｂ）逡逑ＮＤ組和ＨＦＤ組的肝重分別是１．４５±０．０６和丨．８７±０．１０

逡逑加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ｐ＜０．０１，圖２Ｃ），，ＨＦＤ組的肝指數(shù)（５．３９±０．２２）也較逡逑ＮＤ邋組（４．６５±０．０９）明顯升高（Ｐ＜０．０１，圖邋２Ｅ）。ＭＣＤ邋組的肝重（０．７６±０．０３）逡逑較（：０＞１組的肝重（１．６２土０．０５）明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（？＜０．００１，圖２０），逡逑同時(shí)ＭＣＤ組的肝指數(shù)（４．９４±０．１３）也較ＣＯＮ組（６．３７±０．２１）明顯下降（ＰＣ０．００１，逡逑圖邋２Ｆ）。逡逑＾邋ＷＷ邋＾邋蠢秦？邋＿逡逑？．彟ｉ＇：邋％、二．邋ＭＣＤ逡逑ｒｔ邋＂Ｔ邋—逡逑了…＂…ＩＨ邋＊＊，．邋Ｍ逡逑＜邋’邐．一邋‘：：、久．：．．．通磁么l拀逡逑ＣＤ＊＊＊逡逑２邋ＣＨ｜邐ｉ邐，逡逑§２．５－，邐＊＊邋？邐ｊｉ－邋ｐｎ逡逑ｆ邋ｉ；ｓ邋ｌ—１邋ｍ邋ｉ－邋＿逡逑１４邋■邐＿逡逑Ｅ邐Ｆ逡逑＊！邋…逡逑ｉｒｋ逡逑Ｓ５邋６１邐１邐ｏ６＂邐＇逡逑ｉ－ｎ邋■邐＿逡逑」Ｏ＇＊４－１邋￣ｉ—￣３ｌ邋１邋■邋｜邋Ｕ｜Ｕ逡逑圖２各組小鼠肝臟形態(tài)、肝重及肝指數(shù)的變化情況（＊＊Ｐ＜０．０１，＊＊＊Ｐ＜０．００１）逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２邋Ｃｈａｎｇｅｓ邋ｉｎ邋ｌｉｖｅｒ邋ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R575

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本文編號(hào)：2679042