【摘要】：病毒性肝炎、酒精、藥物等多種病因均可以導(dǎo)致肝臟纖維化,最終進(jìn)展為肝硬化、肝癌。臨床上去除或控制病因可以在一定程度上控制疾病的進(jìn)展,但仍有一些肝纖維化依然持續(xù)存在。研究肝纖維化的發(fā)生機制是阻止肝纖維化發(fā)展及逆轉(zhuǎn)肝纖維化的關(guān)鍵。肝纖維化是肝臟損傷后機體修復(fù)失衡的結(jié)果。肝星狀細(xì)胞在肝纖維發(fā)生過程中起著至關(guān)重要的作用,因此它一直以來被做為抗纖維化治療研究的靶細(xì)胞。抑制肝星狀細(xì)胞活化是目前肝纖維化的治療熱點。使肝星狀細(xì)胞失活和使已活化的肝星狀細(xì)胞被誘導(dǎo)凋亡兩種途徑達(dá)到抗纖維化的目的。盡管抗纖維化臨床研究工作取得一定的進(jìn)展,但除了針對病因的治療療效比較確切以外,其他方法或證據(jù)不足,或療效不滿意,或作用機制不清,或副作用較大不能廣泛用于臨床。即便是針對病因的抗乙型肝炎或丙型肝炎治療,也不能解決全部問題,特別是晚期肝纖維化的治療問題。因此,從基礎(chǔ)研究做起,針對肝纖維化及肝硬化形成的共同關(guān)鍵靶點的治療可能是最有希望的�；罨母涡菭罴�(xì)胞分泌的膠原蛋白過量沉積是導(dǎo)致肝纖維化發(fā)生的主要原因。膠原蛋白中存在的羥基脯氨酸在其它蛋白質(zhì)中不存在,它不是直接參與膠原的生物合成,是在已經(jīng)合成的膠原的肽鏈中通過脯氨酸經(jīng)羥化酶作用轉(zhuǎn)化而來的。因此,干預(yù)4-羥基-脯氨酸羥化酶酶活性已被公認(rèn)為抑制過剩膠原(即纖維化)的有效途徑。本研究收集吉林大學(xué)第一醫(yī)院肝膽外科住院并因膽管癌手術(shù)切除的肝組織10例,通過體外灌注法分離得到原代肝星狀細(xì)胞。我們選取肝星狀細(xì)胞系LX2和原代肝星狀細(xì)胞設(shè)計體外實驗,應(yīng)用新型羥脯氨酸抑制劑BT1001和BT1011進(jìn)行體外刺激,通過免疫組化、流式細(xì)胞術(shù)、Real-Time PCR和Elisa等方法來研究BT1001和BT1011對肝星狀細(xì)胞的作用和機制。同時,利用大鼠體內(nèi)實驗來進(jìn)一步驗證我們的體外實驗結(jié)論。研究表明,BT1001和BT1011可以顯著抑制LX2細(xì)胞分泌的α-SMA的量。BT1001和BT1011高劑量供試品組可以顯著抑制LX2細(xì)胞表達(dá)的Col1A1,而明顯提高LX2細(xì)胞表達(dá)的細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2,可以促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的降解。對于細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑TIMP-1和TIMP-2的表達(dá)沒有作用。與LX2細(xì)胞系相比,人原代肝星狀細(xì)胞HSC細(xì)胞在同等刺激條件下會分泌更高水平的α-SMA。與LX2細(xì)胞系結(jié)果相同,BT1001和BT1011可以顯著抑制HSC細(xì)胞表達(dá)的Col1A1,而明顯提高HSC細(xì)胞表達(dá)的MMP-2。BT1001和BT1011作用于LX2細(xì)胞后,細(xì)胞增殖受到不同程度的抑制,與空白對照組相比均有顯著性差異(P0.05),抑制率最高可達(dá)(42.56±5.21%)。細(xì)胞絕對計數(shù)的分析結(jié)果與MTT相一致。我們在后續(xù)的檢測中發(fā)現(xiàn)BT1001和BT1011引起的LX2細(xì)胞凋亡是通過凋亡基因Caspase-3的活化引起的。將LX2細(xì)胞內(nèi)的Caspase-3基因沉默,發(fā)現(xiàn)BT1001和BT1011引起的LX2細(xì)胞凋亡明顯被抑制。我們后續(xù)進(jìn)行大鼠肝纖維化模型的體內(nèi)實驗觀察。膽總管結(jié)扎手術(shù)誘導(dǎo)大鼠肝纖維化模型,采用隨機分組法將動物分成6組,假手術(shù)組10只動物,模型對照組、低劑量供試品組、中劑量供試品組、高劑量供試品組。奧貝膽酸作為實驗的陽性藥物組。各組動物造模成功后經(jīng)血生化指標(biāo)的檢測、臟器指數(shù)檢測、肝臟組織病理學(xué)損傷和肝臟膠原及其酶檢測等手段證明了造模成功。在本實驗條件下,每天灌胃給予BT1001和BT1011后,大鼠門脈高壓和膠原纖維含量有顯著改善效果,對大鼠膽總管結(jié)扎肝纖維化有預(yù)防治療作用。綜上所述,我們首次在體內(nèi)和體外證明了新型羥基脯氨酸酶抑制劑BT1001和BT1011一方面可以抑制肝星狀細(xì)胞膠原的合成和增強膠原降解的能力來抑制肝纖維化進(jìn)程。另一方面,還可以通過Caspase-3信號通路誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞凋亡而抑制肝纖維化。本研究指出了可以靶向羥基脯氨酸酶治療或緩解肝纖維化的新方向。
【圖文】：

omlinson E. Theory and practice of site-specific drug delivery. Adv Drug Delivery Rev, 1987, 1: 87-1圖 2.3 HepDirect 前藥的肝內(nèi)代謝機制及代謝產(chǎn)物針對脯氨酸羥化酶抑制劑在肝纖維化疾病上應(yīng)用面臨的最大問題，藥物在肝臟集的問題，設(shè)計出了不同于 HOE077 的全新肝靶向給藥策略。首先，在脯氨酸羥抑制劑的設(shè)計上，加入了特定的基團，使得 BCH086 能夠在肝臟細(xì)胞中實現(xiàn)富集時又增加其穿過細(xì)胞壁的難度，使其難于直接發(fā)揮抑制作用。然后，，又對 BCH0行前藥處理，即在 BCH086 上連接保護基團生成 BCH087（實驗表明，BCH087 完失了對脯氨酸羥化酶的抑制活性）。BCH087 有很強的細(xì)胞穿透能力，進(jìn)入肝臟細(xì)，在細(xì)胞色素酶 P450 的作用下分解，釋放出 BCH086，發(fā)揮抑制膠原合成的作用過這樣的策略，可以保證活性成分 BCH086 在肝臟中被大量釋放出來，同時被釋來的 BCH086 又由于自身性質(zhì)，停留在肝臟中，從而實現(xiàn)病灶部位的有效藥物濃

3.1.2.11 統(tǒng)計學(xué)分析數(shù)值結(jié)果導(dǎo)入 Graphpad 進(jìn)行統(tǒng)計與作圖，結(jié)果表示為 x ±SEM。相關(guān)性分析使用SPSS 18.0 進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。3.2 結(jié)果3.2.1 化合物 BT1001 和 BT1011 合成方案3.2.1.1 2 2'-聯(lián)嘧啶類化合物的合成路線如路線 1 所示，2-氰基取代的嘧啶 1 在強堿作用下醇解后與氯化銨反應(yīng)得到脒 2，再與丙二醛反應(yīng)即可獲得 2，2’-聯(lián)嘧啶類化合物 3。如果關(guān)環(huán)時采用不同位置取代的丙二醛類似物即可獲得兩個嘧啶環(huán)上均有取代的化合物 4。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R575.2

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本文編號：2678584