發(fā)布時間：2020-05-24 05:13

【摘要】： 研究目的 1. 通過高脂飲食建立大鼠非酒精性脂肪性肝炎（NASH）肝纖維化模型。 2. 觀察大鼠NASH形成過程中Kupffer細(xì)胞活性的變化，以及NASH大鼠對內(nèi)毒素敏感性的改變，明確NASH時Kupffer細(xì)胞功能的改變。 3. 探討NASH大鼠Kupffer細(xì)胞功能改變的機(jī)制，，包括腸道環(huán)境的變化、腸源性內(nèi)毒素血癥，以及游離脂肪酸、極低密度脂蛋白（VLDL）的作用等方面。 研究方法 1. 以普通飼料+2%膽固醇+10%豬油組成的高脂飼料喂養(yǎng)雄性SD大鼠，在實驗4、8、12、16和24周分批處死。測定體重、肝臟濕重、血脂和血清轉(zhuǎn)氨酶。通過HE染色和VG苦味酸染色觀察肝臟肝細(xì)胞脂肪變性、炎癥和纖維化程度。通過免疫組化了解肝臟Ⅲ型膠原、轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGFβ1）、α－平滑肌肌動蛋白（α-SMA）表達(dá)。 2. 在不同實驗階段，免疫組化染色法動態(tài)觀察高脂飲食模型大鼠肝臟溶菌酶和內(nèi)毒素結(jié)合受體CD14抗原表達(dá)，RT-PCR法觀察肝臟內(nèi)毒素信號受體TLR4 mRNA細(xì)胞因子TNF-α mRNA表達(dá)，ELISA法測定血清細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平。 3. 實驗24周，高脂飲食模型大鼠腹腔內(nèi)注射小劑量的內(nèi)毒素（0.5mg/kg）后觀察24小時生存率，測定血脂、血糖、血清轉(zhuǎn)氨酶，血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平，肝組織行HE染色和VG染色觀察肝臟病理。 4. 在實驗不同階段，鱟試劑偶氮顯色法測定高脂飲食模型大鼠外周血和門靜脈血血清內(nèi)毒素水平。乳果糖組大鼠高脂飲食8周后口服乳果糖水溶液，16周處死，觀察體重、肝臟濕重、血脂、血清轉(zhuǎn)氨酶以及肝臟病理改變。 5. 免疫細(xì)胞化學(xué)法和放射免疫法觀察軟脂酸、油酸、VLDL對巨噬細(xì)胞RAW264.7核因子κB（NFκB）活性和內(nèi)毒素敏感性的影響。 研究結(jié)果 1. 高脂飲食大鼠，4周出現(xiàn)肝細(xì)胞脂肪變性，8周表現(xiàn)為單純性脂肪肝，12周~24周進(jìn)展為脂肪性肝炎，24周還出現(xiàn)肝纖維化。 第4周起高脂飲食模型大鼠肝組織CD14表達(dá)上調(diào)，溶菌酶陽性的Kupffer細(xì)胞被激活，并隨著實驗的進(jìn)行更加明顯。肝臟TLR4mRNA表達(dá)從8周開始上調(diào)，16周和24周表達(dá)最強(qiáng)，TNF-α mRNA在8周~24周均有表達(dá)。血清TNF-α水平從 WP=6 2. 8周起明顯增高，IL-1β從16周起升高，IL-6水平則無明顯變化。 3. 注射內(nèi)毒素后24小時，24周高脂飲食模型大鼠出現(xiàn)急性肝功能衰竭，表現(xiàn)為存活率明顯降低，血糖明顯降低，血清ALT和AST明顯升高，血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平均顯著升高，肝組織炎癥活動度計分明顯升高，肝竇內(nèi)還有大量血細(xì)胞淤滯。 4. 高脂飲食模型大鼠腹主動脈血血清內(nèi)毒素水平在24周明顯升高，門靜脈內(nèi)毒素水平在4周~16周未見明顯升高，但同期門靜脈血清內(nèi)毒素水平高于腹主動脈血水平。乳果糖口服明顯改善高脂飲食大鼠血清轉(zhuǎn)氨酶和肝組織炎癥，但未減輕肝細(xì)胞脂肪變性程度。 5. 軟脂酸、油酸、VLDL處理24小時可以使RAW264.7細(xì)胞核NFκB陽性率明顯增加，以軟脂酸最為明顯；軟脂酸、油酸、VLDL處理24小時還可使100μg/ml內(nèi)毒素刺激后RAW264.7細(xì)胞生成的TNFα不同程度的增多。 研究結(jié)論 1. 持續(xù)24周的高脂飲食可以誘導(dǎo)雄性SD大鼠非酒精性脂肪性肝炎肝纖維化模型。 2. Kupffer細(xì)胞活化，伴隨內(nèi)毒素受體TLR4和CD14表達(dá)上調(diào)，TNFα等細(xì)胞因子生成增多，是大鼠NASH形成過程中的早期事件，也是NASH大鼠對內(nèi)毒素肝損傷的敏感性增強(qiáng)的重要原因。 3. 肝臟游離脂肪酸和VLDL增多可能是NASH大鼠的Kupffer細(xì)胞活化和內(nèi)毒素敏感性增強(qiáng)的原因之一。 4. 大鼠NASH的早期，并不存在腸源性內(nèi)毒素血癥，但由于Kupffer細(xì)胞內(nèi)毒素敏感性增強(qiáng)，腸道細(xì)菌過度生長以及腸源性內(nèi)毒素仍在NASH的發(fā)病中起了一定的作用。
【圖文】：

表 1-6 大鼠肝臟脂肪變性程度和 HAI 計分時間 組別 n 脂肪變性程度 HAI 計分－ + ++ +++4~24wk 對照組 29 29 0 0 0 0.72±0.414wk 模型組 12 0 6 4 2 1.03±0.788wk 模型組 12 0 1 6 5 1.98±0.90a12wk 模型組 12 0 0 3 9 4.25±1.14a,b16wk 模型組 12 0 0 1 11 5.83±2.01a,c24wk 模型組 9 0 0 3 6 3.83±1.19a,daP<0.01 vs 對照組,bP<0.01 vs 4,8 周模型組,cP<0.05 vs 12 周模型組,dP<0.05 vs 16 周模型組

表 1-6 大鼠肝臟脂肪變性程度和 HAI 計分時間 組別 n 脂肪變性程度 HAI 計分－ + ++ +++4~24wk 對照組 29 29 0 0 0 0.72±0.414wk 模型組 12 0 6 4 2 1.03±0.788wk 模型組 12 0 1 6 5 1.98±0.90a12wk 模型組 12 0 0 3 9 4.25±1.14a,b16wk 模型組 12 0 0 1 11 5.83±2.01a,c24wk 模型組 9 0 0 3 6 3.83±1.19a,daP<0.01 vs 對照組,bP<0.01 vs 4,8 周模型組,cP<0.05 vs 12 周模型組,dP<0.05 vs 16 周模型組
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2003
【分類號】：R575.5

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 郭江紅;內(nèi)毒素誘發(fā)非酒精性脂肪性肝炎機(jī)制的研究[D];山西醫(yī)科大學(xué);2010年

本文編號：2678509