【摘要】： 前言 炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)是一組累及胃腸道的自身免疫性疾病，包括潰瘍性結(jié)腸炎(uclerative colitis，UC)和Crohn病(Crohn’sdisease，CD)。近年來(lái)，炎癥性腸病(IBD)尤其是潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)。其病因、發(fā)病機(jī)制目前仍不明確，認(rèn)為與免疫、環(huán)境、感染及遺傳等多種因素相互作用有關(guān)，其中免疫因素在IBD發(fā)病中起著重要作用，且已成為研究熱點(diǎn)。 炎癥性腸病由過(guò)強(qiáng)的免疫反應(yīng)所介導(dǎo)，T淋巴細(xì)胞在其中起重要作用，但T胞介導(dǎo)的免疫失耐受機(jī)制不很清楚。機(jī)體內(nèi)存在以抑制免疫反應(yīng)為主要功能特點(diǎn)的較獨(dú)立的CD4~+T淋巴細(xì)胞亞群(現(xiàn)傾向于稱為調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞，Treg)，其中CD4~+CD25~+T細(xì)胞是目前所認(rèn)識(shí)的最重要的一群，調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞／致病性T淋巴細(xì)胞平衡是機(jī)體調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的重要模式之一，其紊亂可能是很多自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制。過(guò)強(qiáng)的免疫反應(yīng)可由致病性T細(xì)胞(促炎促免疫T細(xì)胞)原發(fā)性功能增強(qiáng)引起，也可能由調(diào)節(jié)性T細(xì)胞免疫抑制功能原發(fā)性下降所引起。研究調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在病人機(jī)體內(nèi)的功能狀態(tài)，回答炎癥性腸病的發(fā)病是否與調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞的抗原特異性免疫抑制功能缺陷有關(guān)是值得嘗試的。 從正常人和UC患者外周血中收集并分離淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞，用自體腸道菌群制作成抗原，在體外培養(yǎng)中刺激淋巴細(xì)胞，然后檢測(cè)代表調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的表型CD25、CD152、CD45RB(CD45RO)，轉(zhuǎn)錄因子FOXP3，以及細(xì)胞因子IL-6、TNF-α、IL-10、IFN-γ和IL-4等，能夠初步的評(píng)介出調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的在UC中的數(shù)量及功能狀態(tài)。 材料與方法 一、材料 研究對(duì)象均來(lái)源于于中國(guó)醫(yī)科大學(xué)盛京醫(yī)院內(nèi)鏡中心做電子腸鏡檢查者。對(duì)照組15例，男8例，女7例，年齡20-57歲，平均36歲；潰瘍性結(jié)腸炎(UC)組23例，男14例，女9例，年齡16-55歲，平均33歲。 二、主要試劑及儀器 Human Regulatory T Cell Staining Kit，CD4(7E14)-FITC／CD25(1TYV)-PECocktail，抗人CD45RO(UCHL1)／Biotin和CD152／Biotin，ELISA Kit，考馬斯亮藍(lán)總蛋白定量試劑等。流式細(xì)胞儀、低速低溫離心機(jī)、CO_2孵箱、超聲細(xì)胞破碎儀、酶標(biāo)儀、可見(jiàn)光分光光度計(jì)等 三、淋巴／單核細(xì)胞分離 用肝素抗凝管采外周血10mL，10min內(nèi)用RPMI1640(含10mmol／LHEPES，100kU／L青霉素、30mg／L慶大霉素)10mL稀釋后加入2個(gè)15mL離心管，用連接6號(hào)加長(zhǎng)針頭的注射器抽L(zhǎng)ympholyte-H(1．077 kg/L)，每管4mL緩慢加在稀釋血液下面，1200r／min離心20min，取灰白層單個(gè)核細(xì)胞懸液，PBS洗2次，用5mL RPMI1640(含100mL／L胎牛血清，HEPES及雙抗)混懸細(xì)胞，將低密度Percoll(1．068kg/mL，335mmol／L)4mL和高密度Percoll(1．080 kg/mL，335mmol／L)2mL分層鋪在細(xì)胞懸液下面，2000 r／min離心15min，取低密度Percoll中段以上及至高密度Percoll中段的細(xì)胞懸液，分別作為單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，PBS洗2次，苔盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞均在96％以上，取細(xì)胞懸液作離心涂片，Wrights-Giemsa染色鑒定，淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞的純度分別在97％和90％以上。 四、腸道菌群抗原的制作 腸鏡下取大腸標(biāo)本，將其表面所帶細(xì)菌接種到50ml皰肉培養(yǎng)基中，液體石蠟封閉，37℃培養(yǎng)48小時(shí)，離心、超聲破碎及考馬斯亮藍(lán)法測(cè)細(xì)菌抗原總蛋白濃度。 五、細(xì)胞培養(yǎng) 培養(yǎng)基為約含10％自身血漿的RPMI-1640，濾除去血小板，用含雙抗(100μ／ml青霉素+30μg／ml慶大霉素)、10mM HEPES及0．05mMβ-ME的RPMI-1640稀釋后作為完全培養(yǎng)基。單核細(xì)胞以1×10~5個(gè)／孔加入96孔板，并以20μg／ml加入自身來(lái)源的腸道厭氧菌群抗原，對(duì)照孔不加細(xì)菌抗原，16小時(shí)后每隔2小時(shí)半量換液一次，共4次，以稀釋除去細(xì)菌抗原，然后按8×10~4／孔加入自身的淋巴細(xì)胞，隔天半量換液一次。 六、流式細(xì)胞術(shù) 分離第2天及混合培養(yǎng)第14天的淋巴細(xì)胞用于流式細(xì)胞檢測(cè)CD4、CD25、CD45RO、CD152及FOXP3的表達(dá)，操作按照試劑盒說(shuō)明。 七、ELISA 培養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子IL-6、TNF-α、IL-10、IFN-γ和IL-4的濃度用ELISA檢測(cè)，按照說(shuō)明操作。 八、統(tǒng)計(jì)分析 所有數(shù)據(jù)均用Mean±SD表示，計(jì)算用SPSS11．5完成，比較采用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，P0．05和P0．01被認(rèn)為分別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義和顯著意。 結(jié)果 一、淋巴／單核細(xì)胞的分離效果及鑒定 淋巴和單核細(xì)胞計(jì)數(shù)在96％以上，淋巴細(xì)胞的純度為95％以上，單核細(xì)胞的純度在85％以上，從12ml人外周血中分離出1．23±0．33×10~7個(gè)淋巴細(xì)胞和1．76±0．71×10~6個(gè)單核細(xì)胞。 二、未刺激淋巴細(xì)胞CD4、CD25和FOXP3的表達(dá) 外周血淋巴細(xì)胞CD4、CD25、CD25~(hi)、FOXP3的表達(dá)在對(duì)照組和潰瘍性結(jié)腸炎組間無(wú)明顯差別。約60％的CD25~+細(xì)胞同時(shí)表達(dá)FOXP3，85％的CD25~(hi)細(xì)胞同時(shí)表達(dá)FOXP3。無(wú)論在對(duì)照組還是UC組，CD25~(hi)和FOXP3的表達(dá)具有非常顯著的相關(guān)性(P0．001)。 三、未刺激淋巴細(xì)胞CD4、CD25、CD45RO、CD152的表達(dá) 約91％的CD4~+CD25~+T細(xì)胞同時(shí)表達(dá)CD45RO，CD152在CD4~+T細(xì)胞膜表面很少表達(dá)(約占1％)。對(duì)照組與UC組新鮮分離外周血淋巴細(xì)胞在CD45R0和CD152的表達(dá)上沒(méi)有顯著差別。 四、淋巴細(xì)胞在體外培養(yǎng)中經(jīng)自身腸道菌群抗原刺激后，細(xì)胞總數(shù)均增加(與未刺激比較，對(duì)照組和UC組分別平均增加21％和52％，均P0．001)。 CD4~+T細(xì)胞的比例在對(duì)照組和UC組均明顯上升(P0．001)，而FOXP3~+、CD25~+FOXP3~+及CD25~(hi)FOXP3~+T細(xì)胞的比例變化不大。值得注意的是，無(wú)論CD4~+CD25~+FOXP3~+T細(xì)胞占CD4~+CD25~+T細(xì)胞的比例，還是CD4~+CD25~(hi)FOXP3~+T細(xì)胞占CD4~+CD25~(hi) T細(xì)胞的比例，在兩組的所有研究對(duì)象中均呈下降趨勢(shì)(均P0．05)。 五、潰瘍性結(jié)腸炎組外周血淋巴細(xì)胞對(duì)自身腸道菌群抗原體外刺激的增殖比對(duì)照組高(P0．001)，CD25~+或CD25~(hi)T細(xì)胞中FOXP3~+細(xì)胞的比例在刺激后UC組明顯低于對(duì)照組(40．18％vs52．3％或53．90％vs 77．85％，均P0．001)。 六、外周血淋巴細(xì)胞與自身腸道厭氧菌群抗原刺激的單核細(xì)胞混合培養(yǎng)后，由單核細(xì)胞表達(dá)的IL-6和TNF-α在UC組明顯高于對(duì)照組(P0．01)。 討論 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)以調(diào)節(jié)自身T細(xì)胞反應(yīng)為主要功能。CD4~+CD25~+Treg細(xì)胞是目前研究較為深入的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞亞群，分為天然Treg(natural Treg)和獲得性Treg(adaptive Treg)。天然CD4~+CD25~+Treg細(xì)胞由胸腺中T細(xì)胞發(fā)育而來(lái)，在正常人和小鼠的外周血和脾組織的T細(xì)胞中約占5％～10％，在維持機(jī)體免疫自穩(wěn)，調(diào)控免疫應(yīng)答方面起重要作用。 CD4~+CD25~+Treg細(xì)胞固有的表達(dá)IL-2αR(CD25)、IL-2βR(CDl22)、CILA-4 (CD152)、GITR及高水平的CD44和中／低水平的CD45RB，F(xiàn)oxp3(鼠類為Foxp3)／FOXP3(人類為FOXP3)是特異性表達(dá)在CD4~+CD25~+Treg細(xì)胞上。本研究發(fā)現(xiàn)：外周血中淋巴細(xì)胞CD4、CD25、CD25~(hi)、FOXP3的表達(dá)在對(duì)照組和潰瘍性結(jié)腸炎組間無(wú)明顯差別，表明IBD患者外周血中CD4~+CD25~+Treg保持了他們的抑制活性。約60％的CD25~+T細(xì)胞同時(shí)表達(dá)FOXP3，85％的CD25~(hi)細(xì)胞同時(shí)表達(dá)FOXP3。無(wú)論在對(duì)照組還是UC組，CD25~(hi)和FOXP3的表達(dá)具有非常顯著的相關(guān)性(P0．001)。FOXP3被認(rèn)為是CD4~+CD25~+Treg細(xì)胞的特異性分子標(biāo)記物，對(duì)CD4~+CD25~+Treg發(fā)揮功能是必需的，是Treg發(fā)育的一個(gè)重要開(kāi)關(guān)，并為從分子水平揭示CD4~+CD25~+Treg細(xì)胞的發(fā)育及功能提供了新的研究途徑。 CD45RO~+細(xì)胞代表已經(jīng)抗原刺激而分化的功能細(xì)胞，稱為記憶性T細(xì)胞，為了探索CD4~+CD25~+Treg細(xì)胞與記憶性T細(xì)胞的關(guān)系，我們同時(shí)檢測(cè)了CD4、CD25和CD45RO的表達(dá)。發(fā)現(xiàn)約91％的CD4~+CD25~+T細(xì)胞同時(shí)表達(dá)CD45RO，說(shuō)明CD4~+CD25~+Treg細(xì)胞主要存在于記憶性T細(xì)胞池中，提示曾被接受過(guò)抗原刺激，其只占記憶性T細(xì)胞的1／5�；顒�(dòng)期IBD患者腸粘膜記憶性T淋巴細(xì)胞的CD45RO~+表達(dá)增加，而且腸粘膜淋巴細(xì)胞表達(dá)早期激活抗原增加，這說(shuō)明IBD患者腸粘膜T淋巴細(xì)胞的活性增強(qiáng)，免疫反應(yīng)性增強(qiáng)。 CILA-4(CD152)是重要的負(fù)向協(xié)同刺激分子配體，參與免疫反應(yīng)的負(fù)向調(diào)節(jié)，自然產(chǎn)生的CILA-4~+(CD152)GITR~+CD25~+T細(xì)胞亞群對(duì)自身免疫性疾病有很強(qiáng)的抑制功能。我們的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)CD4~+T細(xì)胞膜表面很少表達(dá)CD152(約占1％)。對(duì)照組與UC組新鮮分離外周血淋巴細(xì)胞在CD45R0和CD152的表達(dá)上沒(méi)有顯著差別。 免疫反應(yīng)異常是IBD主要發(fā)病機(jī)制之一。正常個(gè)體大部分腸黏膜T細(xì)胞的主要刺激源于正常菌群，正常菌群抗原穿透黏膜固有層并持續(xù)存在，便會(huì)引起炎癥性腸病(IBD)。在無(wú)菌環(huán)境下，給小鼠回輸缺少CD4~+CD25~+Treg細(xì)胞不會(huì)引起IBD的發(fā)生，由此可見(jiàn)CD4~+CD25~+Treg細(xì)胞主要抑制過(guò)度抗病原體免疫，從而抑制對(duì)宿主過(guò)度的免疫病理?yè)p傷。我們用自身腸道菌群制備成抗原，與自體淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)所有研究對(duì)象的淋巴細(xì)胞在體外培養(yǎng)中，經(jīng)自身腸道菌群抗原刺激后，細(xì)胞總數(shù)均增加，CD4~+T細(xì)胞的比例在對(duì)照組和UC組均明顯上升，而FOXP3~+、CD25~+FOXP3~+及CD25~(hi)FOXP3~+T細(xì)胞的比例變化不大，CD4~+CD25~+FOXP3~+T細(xì)胞占CD4~+CD25~+T細(xì)胞的比例及CD4~+CD25~(hi)FOXP3~+T細(xì)胞占CD4~+CD25~(hi)T細(xì)胞的比例，在兩組的所有研究對(duì)象中均呈下降趨勢(shì)。CD25~+或CD25~(hi)T細(xì)胞中FOXP3~+細(xì)胞的比例在刺激后UC組明顯低于對(duì)照組。提示活化增殖的細(xì)胞中主要是CD4~+CD25~+FOXP3~-反應(yīng)性T細(xì)胞，而不是CD4~+CD25~+FOXP3~+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，，尤其明顯見(jiàn)于潰瘍性結(jié)腸炎組，說(shuō)明UC的發(fā)病可能與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量減少或功能障礙有關(guān)。 腸抗原物質(zhì)刺激和激活淋巴細(xì)胞和／或巨噬細(xì)胞，都能合成和分泌一些致炎介質(zhì)，即促炎性細(xì)胞因子和抗炎性細(xì)胞因子，二者之間的平衡失調(diào)是IBD的另一個(gè)重要發(fā)病機(jī)制。促炎性細(xì)胞因子IL-6是炎癥反應(yīng)中重要細(xì)胞因子，主要參與T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的激活。給嚴(yán)重免疫缺陷綜合癥小鼠注入IL-6R單克隆抗體，在輸入CD45RB~(high)T細(xì)胞后，可以免得結(jié)腸炎；IL-6缺陷小鼠不易感染結(jié)腸炎。作為一種炎性蛋白，TNF-α在IBD發(fā)病中的作用是使炎性細(xì)胞聚集到局部炎癥組織導(dǎo)致水腫，并參與肉芽組織形成。IBD患者腸道組織炎癥與IL-1β、IL-6、TNF-α高表達(dá)相關(guān)。本研究中，由單核細(xì)胞表達(dá)的IL-6和TNF-α在UC組明顯高于對(duì)照(P0．01)，作為T(mén)h1細(xì)胞標(biāo)記的IFN-γ、Th2標(biāo)記的IL-4及重要的免疫抑制性細(xì)胞因子IL-10只低度表達(dá)，說(shuō)明UC發(fā)病與促炎和抑炎兩類細(xì)胞因子的比例失衡有關(guān)，UC的腸道炎癥反應(yīng)部分是由IL-6和TNF-α介導(dǎo)的。 結(jié)論 1、外周血中淋巴細(xì)胞CD4、CD25、CD25~(hi)、FOXP3及CD45R0和CD152的表達(dá)上，在對(duì)照組和潰瘍性結(jié)腸炎組組間無(wú)明顯差別，UC患者外周血中CD4~+CD25~+Treg保持了他們的抑制活性。 2、對(duì)照組和UC組外周血CD4~+CD25~+Treg細(xì)胞中，CD25~(hi)和FOXP3的表達(dá)具有非常顯著的相關(guān)性，F(xiàn)OXP3是CD4~+CD25~+Treg細(xì)胞的特異性分子標(biāo)記物，對(duì)CD4~+CD25~+Treg發(fā)揮功能是必需的，是Treg發(fā)育的一個(gè)重要開(kāi)關(guān)。 3、所有研究對(duì)象的淋巴細(xì)胞在體外培養(yǎng)中，經(jīng)自身腸道菌群抗原刺激后，細(xì)胞總數(shù)均增加，活化增殖的細(xì)胞中主要是CD4~+CD25~+FOXP3反應(yīng)性T細(xì)胞，而不是CD4~+CD25~+FOXP3~+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，尤其明顯見(jiàn)于潰瘍性結(jié)腸炎組，CD25~+或CD25~(hi)T細(xì)胞中FOXP3~+細(xì)胞的比例在刺激后UC組明顯低于對(duì)照組。UC的發(fā)病可能與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分化不足或功能障礙有關(guān)。 4、外周血淋巴細(xì)胞與自身腸道厭氧菌群抗原刺激的單核細(xì)胞混合培養(yǎng)后，由單核細(xì)胞表達(dá)的IL-6和TNF-α在UC組明顯高于對(duì)照組，UC的腸道炎癥反應(yīng)部分是由IL-6和TNF-α介導(dǎo)的。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R574.6

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2672739