【摘要】： 前言 炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)是一組累及胃腸道的自身免疫性疾病，包括潰瘍性結(jié)腸炎(uclerative colitis，UC)和Crohn病(Crohn’sdisease，CD)。近年來，炎癥性腸病(IBD)尤其是潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病率呈逐年上升趨勢。其病因、發(fā)病機制目前仍不明確，認為與免疫、環(huán)境、感染及遺傳等多種因素相互作用有關(guān)，其中免疫因素在IBD發(fā)病中起著重要作用，且已成為研究熱點。 炎癥性腸病由過強的免疫反應(yīng)所介導(dǎo)，T淋巴細胞在其中起重要作用，但T胞介導(dǎo)的免疫失耐受機制不很清楚。機體內(nèi)存在以抑制免疫反應(yīng)為主要功能特點的較獨立的CD4~+T淋巴細胞亞群(現(xiàn)傾向于稱為調(diào)節(jié)性T淋巴細胞，Treg)，其中CD4~+CD25~+T細胞是目前所認識的最重要的一群，調(diào)節(jié)性T淋巴細胞／致病性T淋巴細胞平衡是機體調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的重要模式之一，其紊亂可能是很多自身免疫性疾病的發(fā)病機制。過強的免疫反應(yīng)可由致病性T細胞(促炎促免疫T細胞)原發(fā)性功能增強引起，也可能由調(diào)節(jié)性T細胞免疫抑制功能原發(fā)性下降所引起。研究調(diào)節(jié)性T細胞在病人機體內(nèi)的功能狀態(tài)，回答炎癥性腸病的發(fā)病是否與調(diào)節(jié)性T淋巴細胞的抗原特異性免疫抑制功能缺陷有關(guān)是值得嘗試的。 從正常人和UC患者外周血中收集并分離淋巴細胞和單核細胞，用自體腸道菌群制作成抗原，在體外培養(yǎng)中刺激淋巴細胞，然后檢測代表調(diào)節(jié)性T細胞的表型CD25、CD152、CD45RB(CD45RO)，轉(zhuǎn)錄因子FOXP3，以及細胞因子IL-6、TNF-α、IL-10、IFN-γ和IL-4等，能夠初步的評介出調(diào)節(jié)性T細胞的在UC中的數(shù)量及功能狀態(tài)。 材料與方法 一、材料 研究對象均來源于于中國醫(yī)科大學(xué)盛京醫(yī)院內(nèi)鏡中心做電子腸鏡檢查者。對照組15例，男8例，女7例，年齡20-57歲，平均36歲；潰瘍性結(jié)腸炎(UC)組23例，男14例，女9例，年齡16-55歲，平均33歲。 二、主要試劑及儀器 Human Regulatory T Cell Staining Kit，CD4(7E14)-FITC／CD25(1TYV)-PECocktail，抗人CD45RO(UCHL1)／Biotin和CD152／Biotin，ELISA Kit，考馬斯亮藍總蛋白定量試劑等。流式細胞儀、低速低溫離心機、CO_2孵箱、超聲細胞破碎儀、酶標儀、可見光分光光度計等 三、淋巴／單核細胞分離 用肝素抗凝管采外周血10mL，10min內(nèi)用RPMI1640(含10mmol／LHEPES，100kU／L青霉素、30mg／L慶大霉素)10mL稀釋后加入2個15mL離心管，用連接6號加長針頭的注射器抽Lympholyte-H(1．077 kg/L)，每管4mL緩慢加在稀釋血液下面，1200r／min離心20min，取灰白層單個核細胞懸液，PBS洗2次，用5mL RPMI1640(含100mL／L胎牛血清，HEPES及雙抗)混懸細胞，將低密度Percoll(1．068kg/mL，335mmol／L)4mL和高密度Percoll(1．080 kg/mL，335mmol／L)2mL分層鋪在細胞懸液下面，2000 r／min離心15min，取低密度Percoll中段以上及至高密度Percoll中段的細胞懸液，分別作為單核細胞和淋巴細胞，PBS洗2次，苔盼藍染色計數(shù)活細胞均在96％以上，取細胞懸液作離心涂片，Wrights-Giemsa染色鑒定，淋巴細胞和單核細胞的純度分別在97％和90％以上。 四、腸道菌群抗原的制作 腸鏡下取大腸標本，將其表面所帶細菌接種到50ml皰肉培養(yǎng)基中，液體石蠟封閉，37℃培養(yǎng)48小時，離心、超聲破碎及考馬斯亮藍法測細菌抗原總蛋白濃度。 五、細胞培養(yǎng) 培養(yǎng)基為約含10％自身血漿的RPMI-1640，濾除去血小板，用含雙抗(100μ／ml青霉素+30μg／ml慶大霉素)、10mM HEPES及0．05mMβ-ME的RPMI-1640稀釋后作為完全培養(yǎng)基。單核細胞以1×10~5個／孔加入96孔板，并以20μg／ml加入自身來源的腸道厭氧菌群抗原，對照孔不加細菌抗原，16小時后每隔2小時半量換液一次，共4次，以稀釋除去細菌抗原，然后按8×10~4／孔加入自身的淋巴細胞，隔天半量換液一次。 六、流式細胞術(shù) 分離第2天及混合培養(yǎng)第14天的淋巴細胞用于流式細胞檢測CD4、CD25、CD45RO、CD152及FOXP3的表達，操作按照試劑盒說明。 七、ELISA 培養(yǎng)上清液中細胞因子IL-6、TNF-α、IL-10、IFN-γ和IL-4的濃度用ELISA檢測，按照說明操作。 八、統(tǒng)計分析 所有數(shù)據(jù)均用Mean±SD表示，計算用SPSS11．5完成，比較采用獨立樣本的t檢驗，P0．05和P0．01被認為分別具有統(tǒng)計學(xué)意義和顯著意。 結(jié)果 一、淋巴／單核細胞的分離效果及鑒定 淋巴和單核細胞計數(shù)在96％以上，淋巴細胞的純度為95％以上，單核細胞的純度在85％以上，從12ml人外周血中分離出1．23±0．33×10~7個淋巴細胞和1．76±0．71×10~6個單核細胞。 二、未刺激淋巴細胞CD4、CD25和FOXP3的表達 外周血淋巴細胞CD4、CD25、CD25~(hi)、FOXP3的表達在對照組和潰瘍性結(jié)腸炎組間無明顯差別。約60％的CD25~+細胞同時表達FOXP3，85％的CD25~(hi)細胞同時表達FOXP3。無論在對照組還是UC組，CD25~(hi)和FOXP3的表達具有非常顯著的相關(guān)性(P0．001)。 三、未刺激淋巴細胞CD4、CD25、CD45RO、CD152的表達 約91％的CD4~+CD25~+T細胞同時表達CD45RO，CD152在CD4~+T細胞膜表面很少表達(約占1％)。對照組與UC組新鮮分離外周血淋巴細胞在CD45R0和CD152的表達上沒有顯著差別。 四、淋巴細胞在體外培養(yǎng)中經(jīng)自身腸道菌群抗原刺激后，細胞總數(shù)均增加(與未刺激比較，對照組和UC組分別平均增加21％和52％，均P0．001)。 CD4~+T細胞的比例在對照組和UC組均明顯上升(P0．001)，而FOXP3~+、CD25~+FOXP3~+及CD25~(hi)FOXP3~+T細胞的比例變化不大。值得注意的是，無論CD4~+CD25~+FOXP3~+T細胞占CD4~+CD25~+T細胞的比例，還是CD4~+CD25~(hi)FOXP3~+T細胞占CD4~+CD25~(hi) T細胞的比例，在兩組的所有研究對象中均呈下降趨勢(均P0．05)。 五、潰瘍性結(jié)腸炎組外周血淋巴細胞對自身腸道菌群抗原體外刺激的增殖比對照組高(P0．001)，CD25~+或CD25~(hi)T細胞中FOXP3~+細胞的比例在刺激后UC組明顯低于對照組(40．18％vs52．3％或53．90％vs 77．85％，均P0．001)。 六、外周血淋巴細胞與自身腸道厭氧菌群抗原刺激的單核細胞混合培養(yǎng)后，由單核細胞表達的IL-6和TNF-α在UC組明顯高于對照組(P0．01)。 討論 調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)以調(diào)節(jié)自身T細胞反應(yīng)為主要功能。CD4~+CD25~+Treg細胞是目前研究較為深入的調(diào)節(jié)性T細胞亞群，分為天然Treg(natural Treg)和獲得性Treg(adaptive Treg)。天然CD4~+CD25~+Treg細胞由胸腺中T細胞發(fā)育而來，在正常人和小鼠的外周血和脾組織的T細胞中約占5％～10％，在維持機體免疫自穩(wěn)，調(diào)控免疫應(yīng)答方面起重要作用。 CD4~+CD25~+Treg細胞固有的表達IL-2αR(CD25)、IL-2βR(CDl22)、CILA-4 (CD152)、GITR及高水平的CD44和中／低水平的CD45RB，F(xiàn)oxp3(鼠類為Foxp3)／FOXP3(人類為FOXP3)是特異性表達在CD4~+CD25~+Treg細胞上。本研究發(fā)現(xiàn)：外周血中淋巴細胞CD4、CD25、CD25~(hi)、FOXP3的表達在對照組和潰瘍性結(jié)腸炎組間無明顯差別，表明IBD患者外周血中CD4~+CD25~+Treg保持了他們的抑制活性。約60％的CD25~+T細胞同時表達FOXP3，85％的CD25~(hi)細胞同時表達FOXP3。無論在對照組還是UC組，CD25~(hi)和FOXP3的表達具有非常顯著的相關(guān)性(P0．001)。FOXP3被認為是CD4~+CD25~+Treg細胞的特異性分子標記物，對CD4~+CD25~+Treg發(fā)揮功能是必需的，是Treg發(fā)育的一個重要開關(guān)，并為從分子水平揭示CD4~+CD25~+Treg細胞的發(fā)育及功能提供了新的研究途徑。 CD45RO~+細胞代表已經(jīng)抗原刺激而分化的功能細胞，稱為記憶性T細胞，為了探索CD4~+CD25~+Treg細胞與記憶性T細胞的關(guān)系，我們同時檢測了CD4、CD25和CD45RO的表達。發(fā)現(xiàn)約91％的CD4~+CD25~+T細胞同時表達CD45RO，說明CD4~+CD25~+Treg細胞主要存在于記憶性T細胞池中，提示曾被接受過抗原刺激，其只占記憶性T細胞的1／5。活動期IBD患者腸粘膜記憶性T淋巴細胞的CD45RO~+表達增加，而且腸粘膜淋巴細胞表達早期激活抗原增加，這說明IBD患者腸粘膜T淋巴細胞的活性增強，免疫反應(yīng)性增強。 CILA-4(CD152)是重要的負向協(xié)同刺激分子配體，參與免疫反應(yīng)的負向調(diào)節(jié)，自然產(chǎn)生的CILA-4~+(CD152)GITR~+CD25~+T細胞亞群對自身免疫性疾病有很強的抑制功能。我們的檢測發(fā)現(xiàn)CD4~+T細胞膜表面很少表達CD152(約占1％)。對照組與UC組新鮮分離外周血淋巴細胞在CD45R0和CD152的表達上沒有顯著差別。 免疫反應(yīng)異常是IBD主要發(fā)病機制之一。正常個體大部分腸黏膜T細胞的主要刺激源于正常菌群，正常菌群抗原穿透黏膜固有層并持續(xù)存在，便會引起炎癥性腸病(IBD)。在無菌環(huán)境下，給小鼠回輸缺少CD4~+CD25~+Treg細胞不會引起IBD的發(fā)生，由此可見CD4~+CD25~+Treg細胞主要抑制過度抗病原體免疫，從而抑制對宿主過度的免疫病理損傷。我們用自身腸道菌群制備成抗原，與自體淋巴細胞混合培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)所有研究對象的淋巴細胞在體外培養(yǎng)中，經(jīng)自身腸道菌群抗原刺激后，細胞總數(shù)均增加，CD4~+T細胞的比例在對照組和UC組均明顯上升，而FOXP3~+、CD25~+FOXP3~+及CD25~(hi)FOXP3~+T細胞的比例變化不大，CD4~+CD25~+FOXP3~+T細胞占CD4~+CD25~+T細胞的比例及CD4~+CD25~(hi)FOXP3~+T細胞占CD4~+CD25~(hi)T細胞的比例，在兩組的所有研究對象中均呈下降趨勢。CD25~+或CD25~(hi)T細胞中FOXP3~+細胞的比例在刺激后UC組明顯低于對照組。提示活化增殖的細胞中主要是CD4~+CD25~+FOXP3~-反應(yīng)性T細胞，而不是CD4~+CD25~+FOXP3~+調(diào)節(jié)性T細胞，，尤其明顯見于潰瘍性結(jié)腸炎組，說明UC的發(fā)病可能與調(diào)節(jié)性T細胞數(shù)量減少或功能障礙有關(guān)。 腸抗原物質(zhì)刺激和激活淋巴細胞和／或巨噬細胞，都能合成和分泌一些致炎介質(zhì)，即促炎性細胞因子和抗炎性細胞因子，二者之間的平衡失調(diào)是IBD的另一個重要發(fā)病機制。促炎性細胞因子IL-6是炎癥反應(yīng)中重要細胞因子，主要參與T淋巴細胞和B淋巴細胞的激活。給嚴重免疫缺陷綜合癥小鼠注入IL-6R單克隆抗體，在輸入CD45RB~(high)T細胞后，可以免得結(jié)腸炎；IL-6缺陷小鼠不易感染結(jié)腸炎。作為一種炎性蛋白，TNF-α在IBD發(fā)病中的作用是使炎性細胞聚集到局部炎癥組織導(dǎo)致水腫，并參與肉芽組織形成。IBD患者腸道組織炎癥與IL-1β、IL-6、TNF-α高表達相關(guān)。本研究中，由單核細胞表達的IL-6和TNF-α在UC組明顯高于對照(P0．01)，作為Th1細胞標記的IFN-γ、Th2標記的IL-4及重要的免疫抑制性細胞因子IL-10只低度表達，說明UC發(fā)病與促炎和抑炎兩類細胞因子的比例失衡有關(guān)，UC的腸道炎癥反應(yīng)部分是由IL-6和TNF-α介導(dǎo)的。 結(jié)論 1、外周血中淋巴細胞CD4、CD25、CD25~(hi)、FOXP3及CD45R0和CD152的表達上，在對照組和潰瘍性結(jié)腸炎組組間無明顯差別，UC患者外周血中CD4~+CD25~+Treg保持了他們的抑制活性。 2、對照組和UC組外周血CD4~+CD25~+Treg細胞中，CD25~(hi)和FOXP3的表達具有非常顯著的相關(guān)性，F(xiàn)OXP3是CD4~+CD25~+Treg細胞的特異性分子標記物，對CD4~+CD25~+Treg發(fā)揮功能是必需的，是Treg發(fā)育的一個重要開關(guān)。 3、所有研究對象的淋巴細胞在體外培養(yǎng)中，經(jīng)自身腸道菌群抗原刺激后，細胞總數(shù)均增加，活化增殖的細胞中主要是CD4~+CD25~+FOXP3反應(yīng)性T細胞，而不是CD4~+CD25~+FOXP3~+調(diào)節(jié)性T細胞，尤其明顯見于潰瘍性結(jié)腸炎組，CD25~+或CD25~(hi)T細胞中FOXP3~+細胞的比例在刺激后UC組明顯低于對照組。UC的發(fā)病可能與調(diào)節(jié)性T細胞分化不足或功能障礙有關(guān)。 4、外周血淋巴細胞與自身腸道厭氧菌群抗原刺激的單核細胞混合培養(yǎng)后，由單核細胞表達的IL-6和TNF-α在UC組明顯高于對照組，UC的腸道炎癥反應(yīng)部分是由IL-6和TNF-α介導(dǎo)的。
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R574.6

【共引文獻】

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本文編號：2672739