【摘要】：研究背景 炎癥性腸病(IBD)是一組反復(fù)發(fā)作非特異性的腸道炎癥性疾病,發(fā)病機(jī)制至今尚未完全闡明,但免疫因素在IBD中重要作用已被廣大學(xué)者所公認(rèn)。Pim-1基因最初是在鼠白血病病毒(MuLV)誘導(dǎo)的T-細(xì)胞淋巴瘤中發(fā)現(xiàn)的,目前研究表明Pim-1激酶在細(xì)胞增殖、分化、凋亡、腫瘤發(fā)生等許多生理病理過程中起重要作用,近年來Pim-1在免疫系統(tǒng)的作用逐漸受到重視,參與控制T淋巴細(xì)胞的增殖與凋亡,但是目前關(guān)于Pim-1信號是否能調(diào)節(jié)IBD腸粘膜固有及適應(yīng)性免疫細(xì)胞功能的研究國內(nèi)外尚未見報(bào)道。本課題利用DSS誘導(dǎo)急性小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型,以觀察Pim-1表達(dá)與腸道炎癥程度關(guān)系為切入點(diǎn),進(jìn)一步使用Pim-1抑制劑,觀察對小鼠潰瘍性結(jié)腸炎的治療作用,并探討對Th1/Th2、Treg/Th17細(xì)胞分化的影響,同時(shí)探討Pim-1信號在巨噬細(xì)胞激活方面的作用,本課題從動(dòng)物、細(xì)胞、分子水平多方面來探討Pim-1信號通路對小鼠潰瘍性結(jié)腸炎腸粘膜固有及適應(yīng)性免疫細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)作用,以闡明Pim-1信號與腸道異常免疫反應(yīng)的關(guān)系,為潰瘍性結(jié)腸炎的治療提供新的靶點(diǎn)、為深入Pim-1信號的藥理研發(fā)提供理論基礎(chǔ)。 第一章Pim-1在小鼠急性潰瘍性結(jié)腸炎模型中的表達(dá) 目的：觀察Pim-1在潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病過程中的動(dòng)態(tài)表達(dá),并觀察其與炎癥程度的相關(guān)性。方法：BALB/c小鼠飲用5%DSS溶液建立急性潰瘍性結(jié)腸炎模型,分別在第0、1、4、7天取結(jié)腸標(biāo)本,利用real time PCR、Western Blot及免疫組化動(dòng)態(tài)觀察Pim-1表達(dá),分析Pim-1的表達(dá)和DAI、組織學(xué)炎癥評分的相關(guān)性。結(jié)果：①飲用5%DSS7天后成功建立小鼠急性潰瘍性結(jié)腸炎動(dòng)物模型,②real time PCR、Western Blot結(jié)果顯示在飲用5%DSS第4、7天后Pim-1表達(dá)較正常組及第1天均明顯升高,P0.05,免疫組化顯示Pim-1主要在淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞表達(dá)。③Pearman相關(guān)分析表明,結(jié)腸組織中Pim-1蛋白與DAI呈正相關(guān)(R=0.868,P0.01),與組織病理學(xué)評分亦呈正相關(guān)(R=0.851,P0.01)。結(jié)論：在潰瘍性結(jié)腸炎起病過程中Pim-1的表達(dá)與腸道炎癥程度呈正相關(guān),Pim-1信號參與腸道炎癥反應(yīng)。 第二章Pim-1信號對Th細(xì)胞分化、及巨噬細(xì)胞激活的影響 目的：用PIM-Inh阻斷Pim-1信號,觀察對DSS誘導(dǎo)的小鼠潰瘍性結(jié)腸炎的治療作用,同時(shí)研究PIM-Inh對腸粘膜中Th細(xì)胞分化及巨噬細(xì)胞激活的影響。方法：①應(yīng)用PIM-Inh阻斷Pim-1信號,治療7天后,觀察對DSS誘導(dǎo)小鼠潰瘍性結(jié)腸炎的治療作用,②ELISA檢測Th細(xì)胞因子(IL4, TGF-β, IFN-γ, IL17),③real time PCR、 Western Blot檢測Th細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)(GATA3, T-bet, Foxp3, RORrt),④Western Blot檢測腸道組織巨噬細(xì)胞激活標(biāo)記物NF-κB,iNOS的表達(dá)。結(jié)果：①PIM-Inh治療組小鼠血便、腹瀉癥狀、DAI評分、病理組織學(xué)評分較DSS模型組均好轉(zhuǎn),②與DSS模型組比較,PIM-Inh治療組腸組織中IFNγ、IL17表達(dá)下降,P0.05,差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,其中高劑量治療組下降更加明顯；PIM-Inh治療組腸組織中TGFβ的表達(dá)較模型組升高,其高劑量組升高較明顯,P0.05,而低劑量治療組與模型組比較,P0.05,差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；PIM-Inh治療組腸組織中IL4的表達(dá)較DSS模型組稍下降,但P0.05,差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,③real time PCR. Western Blot結(jié)果顯示：PIM-Inh治療組腸組織中T-bet, ROR-γt較DSS模型組明顯下降,而FOXP3的表達(dá)比模型組明顯升高,P0.05,差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但是對GATA-3的表達(dá)無明顯影響,④PIM-Inh治療組腸組織中p-NF-κB P65, iNOS的表達(dá)較DSS模型組明顯下降,P0.05。結(jié)論：阻斷Pim-1信號可抑制巨噬細(xì)胞活化、抑制Thl、Thl7為主的炎癥反應(yīng),促進(jìn)向Treg細(xì)胞分化,從而對DSS誘導(dǎo)的小鼠潰瘍性結(jié)腸炎具有治療作用。 第三章Pim-1對TLR4/NF-KB信號通路的調(diào)節(jié) 目的：觀察LPS對Pim-1表達(dá)的影響,阻斷Pim-1對TLR4/NF-KB信號通路的影響方法：①不同劑量LPS作用于RAW264.7巨噬細(xì)胞,分別在12h、24h后用real timePCR及Western Blot檢測Pim-1的表達(dá),②在LPS刺激前給予Pim-1特異性抑制齊(PIM-Inh), Western Blot檢測pNF-kB P65的表達(dá),ELISA測定TNF-α的表達(dá)。結(jié)果：①與正常對照比較,100ng/ml,1ug/ml的LPS均可以促進(jìn)Pim-1的表達(dá),其中1ug/ml更加明顯,P0.05,差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；同一濃度LPS作用12h后比24h后Pim-1升高更加明顯,P0.05,差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義②用10umol/L,100umol/L PIM-Inh預(yù)處理后,NF-κBp65、TNFa蛋白的表達(dá)下降,且呈劑量依賴性,即濃度100umol/L時(shí)最為明顯,P0.05,差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而1umol/L PIM-Inh預(yù)處理后對NF-κBp65蛋白表達(dá)無明顯影響,P0.05,差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論：LPS可以誘導(dǎo)Pim-1的表達(dá),阻斷Pim-1可以抑制TLR4/NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R574.62

【引證文獻(xiàn)】

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本文編號：2672717