【摘要】： 目的:為進一步研究HBV表面抗原大蛋白(LHBs)與宿主胰腺細胞的相互作用。方法:1.將酵母細胞表達載體pGBKT7-LHBs轉(zhuǎn)化AH109酵母菌株,與含有胰腺細胞文庫質(zhì)粒的Y187酵母菌株進行配合,行酵母雙雜交,篩選人胰腺中LHBs結(jié)合蛋白基因。2.應用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(Reverse transcription PCR,RT-PCR),擴增人胰腺CDK5RAP3基因。3.構(gòu)建真核表達質(zhì)粒pcDNA-3.1 -myc-his-CDK5RAP3,通過真核表達系統(tǒng),應用免疫共沉淀技術(shù)及Western blotting方法證實LHBs與人胰腺CDK5RAP3蛋白在細胞內(nèi)的相互作用關(guān)系。4.構(gòu)建真核表達質(zhì)粒pACT-CDK5RAP3,通過真核表達系統(tǒng),應用哺乳動物雙雜交技術(shù)證實LHBs與人胰腺CDK5RAP3蛋白在細胞內(nèi)的相互作用關(guān)系。5.構(gòu)建CDK5RAP3的紅色熒光表達載體pDsRed1-N1-CDK5RAP3,將其與綠色熒光表達載體pEGFP-LHBs分別轉(zhuǎn)染Capan2細胞,模擬該蛋白在細胞中的表達,在激光共聚焦顯微鏡下觀察LHBs及CDK5RAP3蛋白的亞細胞定位。結(jié)果:1.成功篩選出人胰腺細胞中11種與LHBs存在相互作用的已知功能蛋白,其中包括羧肽酶B1、胰凝乳蛋白C、人類胰蛋白酶原2、線粒體蛋白基因、組織相容性復合體13、烏頭酸酶1、蛋白酶2、輔脂肪酶以及核糖體蛋白L10a等已知功能蛋白。2.成功擴增人胰腺CDK5RAP3基因。3.成功構(gòu)建CDK5RAP3基因的真核表達載體pcDNA3.1-myc-his-CDK5RAP3,同pcDNA3.1(-)LHBs行免疫共沉淀,證實LHBs與人胰腺CDK5RAP3蛋白在細胞內(nèi)存在相互作用關(guān)系。4.成功構(gòu)建CDK5RAP3基因的真核表達載體pACT-CDK5RAP3,同pBIND-LHBs等共轉(zhuǎn)染Capan 2細胞,行哺乳動物雙雜交,證實LHBs與人胰腺CDK5RAP3蛋白在細胞內(nèi)存在相互作用關(guān)系。5.成功構(gòu)建CDK5RAP3的紅色熒光表達載體,并在Capan2細胞中得到表達。激光共聚焦顯微鏡觀察到LHBs及CDK5RAP3蛋白均主要定位于細胞漿中。結(jié)論:本實驗成功篩選人胰腺中LHBs結(jié)合蛋白基因,并且證實LHBs與人胰腺CDK5RAP3蛋白在細胞內(nèi)存在相互作用,為下一步研究LHBs的作用機制奠定基礎。
【圖文】：

篩選配合產(chǎn)物在SD/-Trp、SD/-Leu、SD/-Trp-、38。計算可得Y187的成活性為2.93×106c105cfu/ml,配合效率為13.0%。性分析結(jié)果 挑選16個陽性克隆進行測序到11種已知蛋白基因（表2）。pGBKT7-LHBs質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的酵母菌株AH109與胰庫質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化的酵母菌株Y187配合（箭頭所示狀二倍體細胞）

100bp250bp500bp750bp1000bp2000bp1521bpM 15444bp圖 5 Capan2 細胞 mRNA 電泳圖譜M DNA marker圖6 CDK5RAP3基因PCR擴
【學位授予單位】：新疆醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R512.62

【參考文獻】

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1 張艷玲,張宏,梁秀彬,侯平,王海燕;應用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選新基因AngRem104相關(guān)蛋白[J];北京大學學報(醫(yī)學版);2003年04期

2 時德仁,東傳凌,陸立,叢聞天,周燕;肝硬化時糖代謝紊亂與肝細胞胰島素受體及胰腺細胞HBV DNA表達的關(guān)系[J];中華實驗和臨床病毒學雜志;2003年04期

3 范小玲!100011,徐道振!100011,李t，

本文編號：2671594