【摘要】： 目的:為進(jìn)一步研究HBV表面抗原大蛋白(LHBs)與宿主胰腺細(xì)胞的相互作用。方法:1.將酵母細(xì)胞表達(dá)載體pGBKT7-LHBs轉(zhuǎn)化AH109酵母菌株,與含有胰腺細(xì)胞文庫(kù)質(zhì)粒的Y187酵母菌株進(jìn)行配合,行酵母雙雜交,篩選人胰腺中LHBs結(jié)合蛋白基因。2.應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(Reverse transcription PCR,RT-PCR),擴(kuò)增人胰腺CDK5RAP3基因。3.構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-3.1 -myc-his-CDK5RAP3,通過(guò)真核表達(dá)系統(tǒng),應(yīng)用免疫共沉淀技術(shù)及Western blotting方法證實(shí)LHBs與人胰腺CDK5RAP3蛋白在細(xì)胞內(nèi)的相互作用關(guān)系。4.構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pACT-CDK5RAP3,通過(guò)真核表達(dá)系統(tǒng),應(yīng)用哺乳動(dòng)物雙雜交技術(shù)證實(shí)LHBs與人胰腺CDK5RAP3蛋白在細(xì)胞內(nèi)的相互作用關(guān)系。5.構(gòu)建CDK5RAP3的紅色熒光表達(dá)載體pDsRed1-N1-CDK5RAP3,將其與綠色熒光表達(dá)載體pEGFP-LHBs分別轉(zhuǎn)染Capan2細(xì)胞,模擬該蛋白在細(xì)胞中的表達(dá),在激光共聚焦顯微鏡下觀察LHBs及CDK5RAP3蛋白的亞細(xì)胞定位。結(jié)果:1.成功篩選出人胰腺細(xì)胞中11種與LHBs存在相互作用的已知功能蛋白,其中包括羧肽酶B1、胰凝乳蛋白C、人類胰蛋白酶原2、線粒體蛋白基因、組織相容性復(fù)合體13、烏頭酸酶1、蛋白酶2、輔脂肪酶以及核糖體蛋白L10a等已知功能蛋白。2.成功擴(kuò)增人胰腺CDK5RAP3基因。3.成功構(gòu)建CDK5RAP3基因的真核表達(dá)載體pcDNA3.1-myc-his-CDK5RAP3,同pcDNA3.1(-)LHBs行免疫共沉淀,證實(shí)LHBs與人胰腺CDK5RAP3蛋白在細(xì)胞內(nèi)存在相互作用關(guān)系。4.成功構(gòu)建CDK5RAP3基因的真核表達(dá)載體pACT-CDK5RAP3,同pBIND-LHBs等共轉(zhuǎn)染Capan 2細(xì)胞,行哺乳動(dòng)物雙雜交,證實(shí)LHBs與人胰腺CDK5RAP3蛋白在細(xì)胞內(nèi)存在相互作用關(guān)系。5.成功構(gòu)建CDK5RAP3的紅色熒光表達(dá)載體,并在Capan2細(xì)胞中得到表達(dá)。激光共聚焦顯微鏡觀察到LHBs及CDK5RAP3蛋白均主要定位于細(xì)胞漿中。結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)成功篩選人胰腺中LHBs結(jié)合蛋白基因,并且證實(shí)LHBs與人胰腺CDK5RAP3蛋白在細(xì)胞內(nèi)存在相互作用,為下一步研究LHBs的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
【圖文】：

篩選配合產(chǎn)物在SD/-Trp、SD/-Leu、SD/-Trp-、38。計(jì)算可得Y187的成活性為2.93×106c105cfu/ml,配合效率為13.0%。性分析結(jié)果 挑選16個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序到11種已知蛋白基因（表2）。pGBKT7-LHBs質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的酵母菌株AH109與胰庫(kù)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化的酵母菌株Y187配合（箭頭所示狀二倍體細(xì)胞）

100bp250bp500bp750bp1000bp2000bp1521bpM 15444bp圖 5 Capan2 細(xì)胞 mRNA 電泳圖譜M DNA marker圖6 CDK5RAP3基因PCR擴(kuò)
【學(xué)位授予單位】：新疆醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R512.62

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 張艷玲,張宏,梁秀彬,侯平,王海燕;應(yīng)用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選新基因AngRem104相關(guān)蛋白[J];北京大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2003年04期

2 時(shí)德仁,東傳凌,陸立,叢聞天,周燕;肝硬化時(shí)糖代謝紊亂與肝細(xì)胞胰島素受體及胰腺細(xì)胞HBV DNA表達(dá)的關(guān)系[J];中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志;2003年04期

3 范小玲!100011,徐道振!100011,李t，

本文編號(hào)：2671594