【摘要】： 本實驗分為體內(nèi)、體外兩部分。體外實驗中首先采用組織塊貼壁培養(yǎng)法分離、純化、擴增和凍存人臍帶MSCs,MTT法測定P7人臍帶MSCs生長曲線,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期及表面標(biāo)志,透射電鏡觀察MSCs超微結(jié)構(gòu),并檢測其在成骨、成脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)液中的橫向分化能力。而后將P7 MSCs培養(yǎng)在DMEM/F12+10%FBS+HGF 20ng/ml +bFGF10ng/ml+OSM 20ng/ml的誘導(dǎo)體系中,誘導(dǎo)后不同時間點采用免疫細(xì)胞化學(xué)檢測AFP、ALB、CK18等肝系細(xì)胞的標(biāo)志;并檢測培養(yǎng)上清中AFP、ALB及尿素含量;采用PAS法檢測誘導(dǎo)細(xì)胞是否出現(xiàn)糖原;并在電鏡下觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化。 體內(nèi)實驗中首先從Wistar大鼠骨髓中分離、純化、擴增MSCs,取P5對數(shù)生長期細(xì)胞用熒光染料Hochest33342標(biāo)記后,分別經(jīng)尾靜脈、門靜脈、肝內(nèi)注射三種途徑移植于CCl4造成的大鼠急性肝損傷模型體內(nèi);經(jīng)門靜脈、肝內(nèi)注射途徑移植于CCl4制造的大鼠慢性肝損傷模型體內(nèi)。移植后不同時間取材,通過血清學(xué)、病理學(xué)檢測移植效果,探討MSCs移植后修復(fù)急、慢性肝損傷的可行性,以及何種途徑移植更有效。 結(jié)果顯示70%以上人臍帶MSCs處于G0/G1期,為正常二倍體細(xì)胞,強烈表達(dá)CD105、CD90、CD44,基本不表達(dá)CD34、CD31、CD45。具有處于原始狀態(tài)下細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的特點和自我更新能力,并可向成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞分化,復(fù)蘇后人臍帶MSCs的形態(tài)及生長特性沒有明顯變化。而且,人臍帶MSCs可在體外誘導(dǎo)分化為具有肝系細(xì)胞表型和功能的細(xì)胞,聯(lián)合應(yīng)用HGF+bFGF+OSM比應(yīng)用HGF+bFGF的誘導(dǎo)分化效率高。體內(nèi)試驗中,經(jīng)門靜脈、肝內(nèi)注射途徑移植MSCs,對急、慢性肝損傷具有修復(fù)作用,肝內(nèi)注射途徑優(yōu)于門靜脈途徑。 本研究的創(chuàng)新之處:通過組織塊貼壁培養(yǎng)法,系統(tǒng)地建立了穩(wěn)定的人臍帶MSCs體外分離、純化、擴增培養(yǎng)及凍存體系,為人臍帶MSCs最終應(yīng)用于臨床奠定了基礎(chǔ),目前國內(nèi)外均未見報道;確立了高效誘導(dǎo)人臍帶MSCs體外向肝樣細(xì)胞分化的誘導(dǎo)體系,可為肝細(xì)胞移植、生物人工肝、肝組織工程提供大量種子細(xì)胞,國內(nèi)未見報道;通過檢測不同途徑移植的MSCs在急、慢性肝損傷模型中的定位、分化及功能表達(dá),確立了有效的移植途徑,從而探討了新的治療修復(fù)急、慢性肝損傷方法,目前國內(nèi)未見系統(tǒng)報道。
【圖文】：

27圖3.1 原代培養(yǎng)hUCMSCs（倒置相差顯微鏡）A：5d（×100） B:7d（×40）Fig3.1 The hUCMSCs of primary culture（inverted phase contrast microscope）A: on 5th day（×100） B: on 7th day（×40）3.2 結(jié)果3.2.1 hUCMSCs的形態(tài)學(xué)觀察組織塊貼壁后5~6d可見大量細(xì)胞自組織塊游出，于周邊向外貼壁呈放射狀生長（見圖3.1A），，6~8d可見散在分布、貼壁生長的細(xì)胞集落（見圖3.1B）。細(xì)胞多為雙突起的長梭形或扁平形的成纖維樣細(xì)胞，折光度好，核仁明顯。兩周后，細(xì)胞形態(tài)變?yōu)榫坏募忓N形，原代細(xì)胞培養(yǎng)需10~14d。此時細(xì)胞達(dá)到80%~90%左右的匯合程度，消化后，按1：2~1：3的比例傳代，細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶后約30分鐘，約有90%的細(xì)胞迅速貼壁

1期（見圖3.5）。圖3.2 傳代培養(yǎng)3d的P3 hUCMSCs（倒置相差顯微鏡×40）Fig3.2 The hUCMSCs of P3 on 3th dayafter serial subcultivation圖3.3 凍存復(fù)蘇7d的hUCMSCs（倒置相差顯微鏡×40）Fig3.3 The cryopreserved hUCMSCson 7th day
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R575

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2671106