【摘要】：研究背景炎癥性腸病(inflammatory bowel disease,IBD)是一種消化道慢性非感染性炎癥性疾病,主要包括克羅恩病(Crohn’s disease,CD)和潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC),它們以黏液膿血便為主要臨床癥狀。近年來其發(fā)病率一直呈持續(xù)上升趨勢,因其癥狀發(fā)作與緩解反復(fù)交替,給病人帶來了巨大的痛苦和經(jīng)濟負擔(dān)。經(jīng)過多年研究,IBD的確切發(fā)病機制仍不十分清楚,但目前學(xué)者普遍認為腸道微生態(tài)失衡及腸道免疫功能失調(diào)在其發(fā)病過程中起著重要作用。腸道微生態(tài)包括細菌、真菌、病毒等,而目前關(guān)于腸道微生態(tài)的研究都集中在細菌及其代謝產(chǎn)物方面,關(guān)于真菌在IBD中的作用的研究則較少,但已有的研究均表明真菌與IBD密切相關(guān)。釀酒酵母是一種廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)生活的真菌,最新研究發(fā)現(xiàn)在樹突狀細胞(Dendritic cells,DC)和CD4~+T細胞共培養(yǎng)中釀酒酵母不僅不會誘導(dǎo)輔助性T細胞17(T helper cell 17,Th17)的分化,其細胞壁中的甘露聚糖還可以誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細胞分化(regulatory T cell,Treg)。Treg細胞在IBD中發(fā)揮著重要的抑炎作用,因此釀酒酵母細胞壁中的甘露聚糖能否通過促進結(jié)腸炎小鼠中Treg細胞的分化來抑制炎癥值得進一步探究。目的給予Balb/c小鼠自由飲用DSS溶液建立結(jié)腸炎模型,應(yīng)用提取自釀酒酵母細胞壁中的甘露聚糖對其進行干預(yù),探究釀酒酵母細胞壁中的甘露聚糖能否改善DSS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎癥反應(yīng),檢測小鼠結(jié)腸組織中Foxp3和RORγt在蛋白水平的表達,探究釀酒酵母細胞壁中的甘露聚糖對結(jié)腸組織中Th17細胞和Treg細胞分化的影響。方法(1)實驗動物分組:同批次SPF級雄性Balb/c小鼠48只,隨機分為正常對照組、DSS模型組、DSS+甘露聚糖組、甘露聚糖組,每組12只。(2)實驗處理:(1)正常對照組:自由進食水,不做特殊處理。(2)DSS模型組:自由進食水,第8天將飲水更換為2.75%DSS溶液,每兩日更換DSS溶液。(3)DSS+甘露聚糖組:自由進食水,第8天將飲水更換為2.75%DSS溶液,每兩日更換DSS溶液,同時從第1天開始每日給予每只小鼠甘露聚糖50mg/kg/d灌胃。(4)甘露聚糖組:自由進食水,同時從第1天開始每日給予每只小鼠甘露聚糖50mg/kg/d灌胃。(3)每日監(jiān)測小鼠體重并觀察小鼠活動情況,觀察大便性狀以及有無血便,記錄數(shù)據(jù)。(4)當(dāng)DSS模型組出現(xiàn)明顯體重下降及嚴重血便時終止實驗,處死所有小鼠,收集血清,留取結(jié)腸組織。(5)根據(jù)小鼠體重變化、大便性狀以及是否有血便等行疾病活動度(disease activity index,DAI)評分,根據(jù)結(jié)腸組織HE染色結(jié)果行組織學(xué)損傷指數(shù)(Histological index)評分,酶聯(lián)免疫吸附實驗檢測小鼠血清中IL-10、IL-17A表達,免疫組織化學(xué)法檢測結(jié)腸組織中Foxp3表達,Western Blot檢測結(jié)腸組織中Foxp3、RORγt表達。(6)數(shù)據(jù)處理:使用SPSS 21.0軟件對數(shù)據(jù)進行方差同質(zhì)性檢驗,然后采用單因素方差分析對各組間數(shù)據(jù)進行處理,檢驗水準(zhǔn)為α=0.05,當(dāng)P0.05時認為兩組數(shù)據(jù)之間存在顯著性差異,具有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果(1)各組小鼠疾病活動度評分:與正常對照組相比,DSS組均出現(xiàn)明顯的體重下降、稀便及血便;DSS+甘露聚糖組體重下降程度較DDS組輕,炎癥反應(yīng)也較輕。DSS組DAI評分明顯高于正常對照組,DSS+甘露聚糖組DAI評分則低于DSS組,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。甘露聚糖組與正常對照組無明顯差異。(2)各組小鼠HI評分:與正常對照組相比,DSS組結(jié)腸黏膜出現(xiàn)腺體消失,上皮細胞損傷,隱窩破壞及炎性細胞浸潤等。DSS+甘露聚糖組黏膜損傷程度較DDS組輕。甘露聚糖組與正常對照組未見黏膜損傷及炎癥反應(yīng)。DSS組HI評分高于正常對照組,DSS+甘露聚糖組HI評分低于DSS組,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。(3)各組小鼠血清中IL-10、IL-17A的表達:(1)DSS+甘露聚糖組血清中IL-10水平高于DSS組,二者差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),正常組和甘露聚糖組無明顯差異(P0.05)。(2)DSS組血清中IL-17A水平高于DSS+甘露聚糖組,二者差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),甘露聚糖組和正常組無明顯差異。(4)各組小鼠結(jié)腸組織中Foxp3、RORγt表達:(1)DSS+甘露聚糖組結(jié)腸組織中Foxp3水平高于DSS組,二者差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),正常組和甘露聚糖組無明顯差異。(2)DSS組結(jié)腸組織中RORγt水平高于DSS+甘露聚糖組,二者差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),甘露聚糖組和正常組無差異。結(jié)論(1)釀酒酵母細胞壁中的甘露聚糖可以緩解DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎癥反應(yīng);(2)釀酒酵母細胞壁中的甘露聚糖可以誘導(dǎo)Treg細胞分化并促進IL-10分泌,抑制Th17細胞分化及IL-17A分泌。
【圖文】：

注：*：與正常對照組相比，P＜0.05 ＃：與 DSS 模型組相比，P＜0.05圖 1 各組小鼠 DAI 評分2 各組小鼠結(jié)腸長度DSS+甘露聚糖組小鼠結(jié)腸長度大于 DSS 模型組，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。甘露聚糖組與正常對照組無明顯差異，評分結(jié)果見表 4、圖 2。表 4 各組小鼠結(jié)腸長度Group Colon lengthcontrol 9.47±0.41DSS 5.87±0.54*DSS+mannan 7.00±0.64*#mannan 9.50±0.41#注：*：與正常對照組相比，P＜0.05 ＃：與 DSS 模型組相比，P＜0.05

注：*：與正常對照組相比，P＜0.05 ＃：與 DSS 模型組相比，P＜0.05圖 2 各組小鼠結(jié)腸長度3 各組小鼠組織學(xué)損傷指數(shù)正常對照組：結(jié)腸黏膜完整，上皮細胞連接緊密，無破損，隱窩結(jié)構(gòu)正常，腺體排列規(guī)整，未見炎性細胞浸潤；DSS 模型組：結(jié)腸黏膜破損，上皮層完整性破壞，隱窩結(jié)構(gòu)異常，表現(xiàn)為數(shù)量減少，結(jié)構(gòu)不規(guī)則，基底部可見淋巴細胞、漿細胞浸潤；DSS+甘露聚糖組：結(jié)腸黏膜基本完整，上皮細胞損傷及隱窩破壞等較 DSS模型組輕；甘露聚糖組：黏膜完整，隱窩結(jié)構(gòu)及形態(tài)正常，與正常對照組無明顯差異。DSS+甘露聚糖組小鼠 HI 評分低于 DSS 模型組，，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。甘露聚糖組與正常對照組無明顯差異，評分結(jié)果見表 5，HE 染色結(jié)果見圖 4。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R574.62

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本文編號：2668254