【摘要】：研究背景腸易激綜合征(irritable bowel syndrome,IBS)是一種以腹痛和排便習(xí)慣改變?yōu)樘卣鞯墓δ苄晕改c道疾病,其發(fā)病機制復(fù)雜,一般認(rèn)為與內(nèi)臟高敏感、胃腸動力異常、精神心理應(yīng)激、腦-腸軸功能障礙、免疫系統(tǒng)激活和腸道菌群紊亂等因素有關(guān)。盡管對于腸道微生物與IBS之間的關(guān)聯(lián)有越來越多的共識,但是IBS中的特異性微生物特征仍然難以捉摸。多項研究表明,腸道菌群與IBS特征性的內(nèi)臟高敏感有關(guān),例如,益生菌可以有效緩解IBS患者的癥狀,IBS患者的糞便移植到無菌小鼠中可以誘發(fā)內(nèi)臟高敏感。其中,梭桿菌屬在母嬰分離大鼠糞便菌群中的相對豐度與其內(nèi)臟敏感性程度存在相關(guān)性。梭桿菌屬下的具核梭桿菌(Fusobacterium nucleatum)可表達(dá)多種致病因子,在結(jié)直腸腫瘤、炎癥性腸病、闌尾炎組織中含量升高,參與了多種消化系統(tǒng)疾病的致病過程。內(nèi)臟敏感性升高可見于多種動物應(yīng)激模型,其中,母嬰分離大鼠模型的腸道菌群紊亂特征與IBS存在相似性。因此,本研究使用母嬰分離大鼠模型探究具核梭桿菌對內(nèi)臟敏感性和腸道菌群的影響和機制。目的1.探討具核梭桿菌對正常大鼠和母嬰分離大鼠內(nèi)臟敏感性的作用。2.探討具核梭桿菌對正常大鼠和母嬰分離大鼠腸道菌群的影響。3.探討具核梭桿菌在腸道內(nèi)的定植情況及其影響因素。方法1.構(gòu)建動物模型:將32只雄性SD大鼠分為母嬰分離造模大鼠(n=16)和正常喂養(yǎng)大鼠(n=16)。母嬰分離組大鼠在出生后2至14天內(nèi)每天母嬰分離3小時(上午9時至12時),正常喂養(yǎng)組大鼠不作處理。大鼠斷奶后,將上述兩組大鼠分別隨機分為具核梭桿菌灌胃組和生理鹽水灌胃組,即所有大鼠被分為4組:D組(母嬰分離和具核梭桿菌灌胃),M組(母嬰分離和生理鹽水灌胃)、F組(具核梭桿菌灌胃)、N組(生理鹽水灌胃)。灌胃操作分別在第4、5、6、7、8周,D組和F組大鼠的具核梭桿菌灌胃量為109CFU,灌胃體積根據(jù)大鼠體質(zhì)量確定(1ml/100g),M組和N組在相同時間點以等體積的生理鹽水灌胃。2.內(nèi)臟敏感性測定:在大鼠12周齡時,通過向固定于大鼠結(jié)直腸內(nèi)的球囊中注射不同體積生理鹽水(0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.2,1.4,1.6ml),觀察各組大鼠對結(jié)直腸擴張(colorectal distension,CRD)的不同反應(yīng),記錄腹壁撤回反射(abdominal withdraw reflex,AWR)評分。為了衡量每只大鼠的內(nèi)臟敏感性程度,將球囊體積為0.4ml,0.6ml,0.8ml,1.0ml,1.2ml,1.4ml時的AWR評分相加,作為內(nèi)臟敏感性指數(shù)(visceral hypersensitivity index,VHI)進(jìn)行統(tǒng)計分析。3.糞便菌群檢測:收集大鼠在第3、8、12周末的糞便樣本保存于-80℃。提取糞便DNA后進(jìn)行16S rRNA基因測序,分析各組的腸道菌群變化。4.具核梭桿菌特異性IgA檢測:該部分借鑒蛋白印跡法。收集SD大鼠在第3、8、12周末的糞便樣本以適當(dāng)體積生理鹽水稀釋(lg/7ml),離心后取上清作為一抗備用。收集具核梭桿菌重懸于生理鹽水中,超聲破碎法獲得具核梭桿菌總蛋白。將等量的高濃度菌體蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳,蛋白分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜,用牛奶封閉后,依次置于大鼠糞便上清、辣根過氧化酶(horseradish peroxidase,,HRP)標(biāo)記的山羊抗大鼠IgA alpha鏈抗體中進(jìn)行孵育,ECL發(fā)光液顯色曝光。大腸桿菌BL21(DE3)用同樣的方法作為對照。5.抗原鑒定與驗證:將SDS-PAGE電泳后的具核梭桿菌蛋白進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色,選取與特異性條帶位置一致的蛋白進(jìn)行鑒定。構(gòu)建FomA基因的重組大腸桿菌,誘導(dǎo)其分泌重組蛋白后,超聲破碎獲得細(xì)菌總蛋白,按前述方法檢測大鼠糞便上清中針對重組大腸桿菌的特異性IgA,并對考馬斯亮藍(lán)染色后的凝膠進(jìn)行蛋白鑒定。結(jié)果1.內(nèi)臟敏感性評價:4組大鼠的內(nèi)臟敏感性指數(shù)存在統(tǒng)計學(xué)差異。D組和M組大鼠的內(nèi)臟敏感性分別高于F組和N組,D組大鼠內(nèi)臟敏感性高于M組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義,F組和N組大鼠內(nèi)臟敏感性之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。2.腸道菌群改變:具核梭桿菌灌胃和母嬰分離造模均造成了大鼠腸道菌群的紊亂,二者均可降低大鼠腸道菌群的多樣性,造成菌群結(jié)構(gòu)改變,但是各組均未檢測到具核梭桿菌的定植。3.特異性IgA抗體檢測與抗原鑒定:第3周時,各組條帶顏色均較淺;第8、12周時,D組和F組在40kDa和130kDa處出現(xiàn)明顯條帶,而M組和N組在該位置的條帶顏色較淺。大腸桿菌BL21(DE3)用作對照后發(fā)現(xiàn),蛋白條帶顏色淺且條帶位置組成均不相同。因此可初步認(rèn)為大鼠腸道內(nèi)產(chǎn)生了較多針對具核梭桿菌特異性的IgA抗體。蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果顯示在40 kDa和130 kDa處均檢測出由FomA基因編碼的蛋白。FomA基因重組大腸桿菌以同樣方法行蛋白印跡實驗后,相比于普通大腸桿菌,在40 kDa處出現(xiàn)了明顯條帶,蛋白鑒定也確認(rèn)了 FomA蛋白的存在,即FomA蛋白是引起特異性IgA產(chǎn)生的抗原成分。結(jié)論1.具核梭桿菌灌胃可以加劇母嬰分離大鼠的內(nèi)臟敏感性,但是不能使正常大鼠的內(nèi)臟敏感性升高。2.具核梭桿菌灌胃和母嬰分離造模均可引起大鼠腸道菌群紊亂,具核梭桿菌灌胃可通過非定植途徑引起腸道菌群的結(jié)構(gòu)改變。3.具核梭桿菌灌胃使大鼠腸道內(nèi)特異性IgA分泌增多,其中,IgA可以特異性識別具核梭桿菌FomA蛋白。
【圖文】：

３００８９２２條序列納入最終分析。其中序列最少的樣本獲得２３５２２條序列。使用Ｕｓｅａｒｃｈ逡逑軟件結(jié)合ＲＤＰ數(shù)據(jù)庫，對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，按照０．９７相似性獲得１２３９各ＯＴＵ。各逡逑樣本稀釋曲線（圖２）均到達(dá)平臺期，提示測序深度足夠。逡逑Ｒａｒｅｆａｃｔｉｏｎ邋ｃｕｒｖｅｓ逡逑Ｉ邐——３Ｄ逡逑—邐邐＊邐一邋３Ｍ逡逑１逡逑0邋！邋！邋；邋：逡逑１０．０００邐２０邋０００邐３０．０００邐４０．０００逡逑Ｎｕｍｂｅｒ邋ｏｆ邋Ｒｅａｄｓ邋Ｓａｍｐｌｅｄ逡逑圖２．大鼠糞便樣本稀釋曲線。“３Ｄ”表示Ｄ組在第３周時的樣本，以此類推。逡逑２．２大鼠腸道菌群多樣性分析逡逑通過比較大鼠腸道菌群的Ｓｈａｎｎｏｎ指數(shù)對大鼠腸道ko群多樣性進(jìn)行分析。在第３周時，逡逑母嬰分離大鼠和正常詞養(yǎng)的大鼠在Ｓｈａｎｎｏｎ指數(shù)上的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（ｘ＝邋２．２７，邋ｄｆ＝邋１，逡逑／３邋＝邋０．１３，１＜：１＇１１５１＾丨－＇＾１１丨５檢驗，圖３八）。第８周時，４個組的大鼠腸道菌群存在差異，總體逡逑差異有統(tǒng)計學(xué)意義＝邋１０．２９２６，邋ｄｆ＝邋３，邐０．０２，邋Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ檢驗，圖３Ｂ），各組兩兩比逡逑較后發(fā)現(xiàn)，Ｄ組、Ｆ組、Ｍ組的Ｓｈａｎｎｏｎ指數(shù)均低于Ｎ組，差異有統(tǒng)汁學(xué)意義（Ｐ＝０．０１２，逡逑Ｐ＝０．０１２，邋／Ｍ）．００９，Ｍａｎｎ－ＷｈｉｔｎｅｙＵ檢驗），，也就是說，在第８周時Ｄ、Ｆ、Ｍ組的腸道菌逡逑群多樣性相比ＦＮ組降低。第１２周時

通過比較大鼠腸道菌群的Ｓｈａｎｎｏｎ指數(shù)對大鼠腸道ko群多樣性進(jìn)行分析。在第３周時，逡逑母嬰分離大鼠和正常詞養(yǎng)的大鼠在Ｓｈａｎｎｏｎ指數(shù)上的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（ｘ＝邋２．２７，邋ｄｆ＝邋１，逡逑／３邋＝邋０．１３，１＜：１＇１１５１＾丨－＇＾１１丨５檢驗，圖３八）。第８周時，４個組的大鼠腸道菌群存在差異，總體逡逑差異有統(tǒng)計學(xué)意義＝邋１０．２９２６，邋ｄｆ＝邋３，邐０．０２，邋Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ檢驗，圖３Ｂ），各組兩兩比逡逑較后發(fā)現(xiàn)，Ｄ組、Ｆ組、Ｍ組的Ｓｈａｎｎｏｎ指數(shù)均低于Ｎ組，差異有統(tǒng)汁學(xué)意義（Ｐ＝０．０１２，逡逑Ｐ＝０．０１２，邋／Ｍ）．００９，Ｍａｎｎ－ＷｈｉｔｎｅｙＵ檢驗），也就是說，在第８周時Ｄ、Ｆ、Ｍ組的腸道菌逡逑群多樣性相比ＦＮ組降低。第１２周時，各組大鼠的Ｓｈａｎｎｏｎ指數(shù)存在差異，總體差異有統(tǒng)逡逑計學(xué)意義（？（＝邋１０．１２７８，邋￡＾＇＝３，尸＝０．０２，邋Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ檢驗，圖３Ｃ），各組兩兩比較后可知，逡逑２３逡逑
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R574

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 胡琳;張舉之;張萍;肖曉蓉;;血液鏈球菌與牙周可疑致病菌間的關(guān)系[J];中國微生態(tài)學(xué)雜志;1989年02期

2 倪龍興，李潔;具核梭桿菌[J];口腔醫(yī)學(xué);1994年03期

3 李端;劉帥;;牙周炎破壞抗癌防線[J];中老年保健;2015年06期

4 倪龍興;具核梭桿菌的生物學(xué)活性[J];牙體牙髓牙周病學(xué)雜志;1992年03期

5 潘慧;王冬青;;使用高功率LED藍(lán)光與紅色染料的光動力療法對具核梭桿菌的殺菌效果[J];中國激光醫(yī)學(xué)雜志;2018年02期

6 陸詩媛;嚴(yán)婷婷;郭方方;陳縈fE;洪潔;房靜遠(yuǎn);;白介素-22與具核梭桿菌在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的協(xié)同作用[J];中國科學(xué):生命科學(xué);2018年06期

7 陳玉蓮;孫穎;;具核梭桿菌與大腸癌關(guān)系的研究進(jìn)展[J];口腔醫(yī)學(xué);2018年06期

8 王耀生;杜奇峰;李永凱;徐屹;;牙周致病菌的共聚及其對人工牙根面黏附力的影響[J];國際口腔醫(yī)學(xué)雜志;2012年01期

9 張郁,蔭俊,史俊南,肖明振,陳建元,孫葉方;具核梭桿菌內(nèi)毒素對人牙周膜成纖維細(xì)胞和L929細(xì)胞的細(xì)胞毒作用[J];牙體牙髓牙周病學(xué)雜志;1991年01期

10 劉俊超;王晴萱;張冬梅;李琛;王宏巖;趙海礁;潘亞萍;;具核梭桿菌感染KB細(xì)胞影響細(xì)胞增殖和炎癥因子分泌的研究[J];口腔醫(yī)學(xué);2018年02期

相關(guān)會議論文 前3條

1 馬瑞;夏文薇;黃莉莉;;復(fù)方中藥對具核梭桿菌的抑菌作用研究[A];全國第三次牙體牙髓病學(xué)臨床技術(shù)研討會論文匯編[C];2009年

2 王宏巖;劉藎文;寇育榮;李倩;譚麗思;林莉;潘亞萍;;唾液富組蛋白5抑制牙齦卟啉單胞菌與具核梭桿菌共聚的初步研究[A];2017全國口腔生物醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)年會論文匯編[C];2017年

3 俞蓮花;胡大康;李隆祥;曲穎;張嶸;;包裹性膿胸具核梭桿菌和口腔普雷沃菌的分離和鑒定[A];第七屆中國臨床微生物學(xué)大會暨微生物學(xué)與免疫學(xué)論壇論文匯編[C];2016年

相關(guān)重要報紙文章 前1條

1 記者 陶婷婷 通訊員 袁蕙蕓;大腸癌復(fù)發(fā)竟是具核梭桿菌惹的禍[N];上�？萍紙�;2017年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前3條

1 李鑓;具核梭桿菌對牙齦卟啉單胞菌和伴放線聚集桿菌致病作用的影響[D];山東大學(xué);2015年

2 于亞男;大腸腫瘤發(fā)生中腸菌紊亂及小檗堿干預(yù)的研究[D];上海交通大學(xué);2014年

3 高志光;腸道菌群結(jié)構(gòu)異常與大腸癌發(fā)病風(fēng)險及預(yù)后的相關(guān)性研究[D];上海交通大學(xué);2015年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 宋立錦;具核梭桿菌通過非定植途徑引起母嬰分離大鼠腸道菌群紊亂并加劇內(nèi)臟高敏感[D];山東大學(xué);2018年

2 韓丹;具核梭桿菌通過LncRNA EVADR促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖及EMT發(fā)生的機制研究[D];成都醫(yī)學(xué)院;2018年

3 余佳慧;具核梭桿菌促進(jìn)結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展機制相關(guān)性研究[D];西南醫(yī)科大學(xué);2017年

4 林欣;具核梭桿菌通過調(diào)控miR-181b在結(jié)腸癌細(xì)胞中形成炎性微環(huán)境的機制[D];廣州醫(yī)科大學(xué);2017年

5 路洋;具核梭桿菌增強牙齦卟啉單胞菌和伴放線放線桿菌黏附入侵上皮細(xì)胞的能力[D];山東大學(xué);2012年

6 花蕾;消化道共生菌對結(jié)腸炎癥的影響[D];河南大學(xué);2017年

7 費曉露;具核梭桿菌黏附和侵入上皮細(xì)胞的初步研究[D];四川大學(xué);2005年

8 王昆;具核梭桿菌誘導(dǎo)的腸上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)的初步研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2015年

9 陸成華;變形鏈球菌對種植體周圍炎可疑致病菌抑制實驗研究[D];昆明醫(yī)科大學(xué);2012年

10 孫大磊;C反應(yīng)蛋白基因多態(tài)性及牙周致病菌在慢性牙周炎和冠心病相關(guān)性中研究[D];新疆醫(yī)科大學(xué);2011年

本文編號：2667090