【摘要】：目的:本實(shí)驗(yàn)研究阿魏酸(Ferulic acid,FA)聯(lián)用大鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells,ADMSCs)對活化大鼠肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells,HSCs)凋亡的影響。進(jìn)一步探討兩者協(xié)同促HSCs凋亡作用機(jī)制,是否通過調(diào)節(jié)肝星狀細(xì)胞的TGF-β/Smad信號通路來實(shí)現(xiàn)。方法:1、FA最佳藥物作用濃度的確定:(1)用完全培養(yǎng)基將HSCs培養(yǎng)至細(xì)胞密度達(dá)60%-70%時,換無血清培養(yǎng)基,分別培養(yǎng)6h、12h、24h、36h、48h,用四甲基偶氮哇藍(lán)(MTT)法測HSCs的OD值,繪制HSCs生長曲線并確定最適細(xì)胞培養(yǎng)時間。(2)用完全培養(yǎng)基將HSCs培養(yǎng)至細(xì)胞密度約60%-70%時,換用含不同濃度(25-800μg/m L)FA的無血清培養(yǎng)基處理HSCs,用MTT法測HSCs的細(xì)胞增殖抑制率,并計算IC50,確定FA的最佳藥物作用濃度。(3)用完全培養(yǎng)基將ADMSCs培養(yǎng)至細(xì)胞密度達(dá)60%-70%時,換為無血清培養(yǎng),用MTT法檢測FA對ADMSCs的存活率的影響。2、實(shí)驗(yàn)分組:利用Transwell半透膜對ADMSCs和HSCs以1:5的比例建立上下層間接共培養(yǎng)體系,當(dāng)兩者細(xì)胞在完全培養(yǎng)基中達(dá)到60%-70%密度時,換為無血清培養(yǎng),然后將HSCs分為4組:(1)空白對照組:HSCs單獨(dú)培養(yǎng),不加FA和ADMSCs;(2)FA條件對照組:加入FA處理HSCs;(3)ADMSCs條件對照組:加入ADMSCs,用Transwell建立上下雙層細(xì)胞共培養(yǎng)體系。ADMSCs在上層Transwell中培養(yǎng),HSCs在下層6孔板中培養(yǎng);(4)FA/ADMSCs實(shí)驗(yàn)組:在ADMSCs與HSCs共培養(yǎng)體系中加入FA共同作用。3、阿魏酸聯(lián)合脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞對肝星狀細(xì)胞凋亡的影響:用流式細(xì)胞儀檢測各組HSCs的凋亡率;用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測各組HSCs上清液中CollagenⅠ的含量。4、阿魏酸聯(lián)合脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞促肝星狀細(xì)胞對肝星狀細(xì)胞相關(guān)TGF-β/Smad通路研究:利用q RT PCR檢測各組HSCs中TGF-β1、Smad2、Smad3和Smad7 m RNA的表達(dá)水平;Western blot檢測各組HSCs中TGF-β1和Smad7蛋白、Smad2/3磷酸化(p-Smad2/3)表達(dá)變化。結(jié)果:1、MTT結(jié)果顯示:本實(shí)驗(yàn)換為無血清條件后的最適細(xì)胞培養(yǎng)時間為24h;不同濃度FA作用24h后,與未加FA的對照組比較,實(shí)驗(yàn)組HSCs生長抑制率均顯著升高(P0.05)。用SPSS22.0軟件中文版計算出IC50=243μg/m L。結(jié)合本課題前期實(shí)驗(yàn),確定FA的最終藥物處理濃度為200μg/m L;MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示此濃度的FA對ADMSCs的存活率影響不明顯2、流式細(xì)胞儀測HSCs凋亡率結(jié)果示:與空白對照組比較,ADMSCs組中HSCs凋亡率變化無明顯統(tǒng)計學(xué)差異;FA組、FA/ADMSCs實(shí)驗(yàn)組HSCs的凋亡率均明顯增高(P0.05)。與兩條件對照組比較,FA/ADMSCs實(shí)驗(yàn)組中HSCs的凋亡率均顯著升高(P0.05)。ELISA結(jié)果顯示:在無血清條件下,各組HSCs培養(yǎng)24h后,培養(yǎng)上清液中的Collagen I的濃度出現(xiàn)了差異。與空白對照組組比較,ADMSCs組中Collagen I的濃度變化無明顯統(tǒng)計學(xué)差異;FA組、FA/ADMSCs實(shí)驗(yàn)組HSCs的Collagen I濃度均顯著降低(P0.001)。與FA組和ADMSCs組兩條件對照組比較,FA/ADMSCs實(shí)驗(yàn)組上清中的Collagen I含量顯著降低(P0.05或P0.001)。3、q RT PCR和Western blot檢測對肝星狀細(xì)胞TGF-β/Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路結(jié)果顯示:與空白和條件對照組比較:FA/ADMSCs實(shí)驗(yàn)組中HSCs的TGF-β1、Smad2、Smad3m RNA表達(dá)明顯下降,Smad7 m RNA表達(dá)明顯升高(P0.05或P0.01);FA/ADMSCs實(shí)驗(yàn)組中HSCs的TGF-β1蛋白表達(dá)、Smad2/3磷酸化水平顯著降低,而Smad7蛋白表達(dá)水平顯著升高(P0.05)。結(jié)論:阿魏酸聯(lián)合脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞促肝星狀細(xì)胞的凋亡機(jī)制可能是下調(diào)肝星狀細(xì)胞中TGF-β1表達(dá),進(jìn)而導(dǎo)致下游Smad2/3磷酸化活性下降以及Smad7表達(dá)升高,促進(jìn)細(xì)胞凋亡。
【圖文】：

西 南 醫(yī) 科 大 學(xué) 碩 士 學(xué) 位 論 文第一部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果1 HSCs 細(xì)胞形態(tài)及生長狀態(tài)剛復(fù)蘇或傳代后的 HSCs 在倒置顯微鏡下觀察呈圓形，使用含 10%FBS的 DMEM/F-12 培養(yǎng)液培養(yǎng) 6h 后已基本貼壁。培養(yǎng) 12h 后呈扁圓形或橢圓形，一部分細(xì)胞開始伸展出現(xiàn)偽足（如圖 1-A 所示）。培養(yǎng) 24h 后細(xì)胞已完全伸展呈不規(guī)則的三角形或多角形（如圖 1-B 所示）。培養(yǎng) 24h 后細(xì)胞質(zhì)中可見許多折光顆粒，，細(xì)胞呈團(tuán)生長（如圖 1-C 所示）。HSCs 細(xì)胞增殖較快，培養(yǎng) 72h 左右即長滿瓶底（如圖 1-D 所示）。

西 南 醫(yī) 科 大 學(xué) 碩 士 學(xué) 位 論 文2 ADMSCs 細(xì)胞形態(tài)及生長狀態(tài)剛復(fù)蘇的第三代 ADMSCs 在倒置顯微鏡下觀察呈圓形，使用含10%FBS 的 DMEM/F-12 培養(yǎng)液培養(yǎng) 6h 后逐漸貼壁。培養(yǎng) 12h 后細(xì)胞大多數(shù)細(xì)胞已貼壁，呈短梭形。培養(yǎng) 24h 后細(xì)胞逐漸變長。培養(yǎng) 48h 后細(xì)胞部分細(xì)胞呈紡錘形，細(xì)胞體積逐漸增大(見圖 2-A)。培養(yǎng) 4-5 天后細(xì)胞體積較大，呈長梭形，呈漩渦狀生長，細(xì)胞已達(dá)到 80%-90%融合(見圖 2-B)，按1:3 傳代，傳至第五代凍存?zhèn)溆谩?
【學(xué)位授予單位】：西南醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R575

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本文編號：2666875