【摘要】：已有研究支持乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)存在感染患者外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)等肝外組織的現(xiàn)象,并且在其中檢測到乙型肝炎病毒抗原及HBV DNA的復(fù)制。HBV共價閉合環(huán)狀DNA (covalently closed circular DNA, cccDNA)作為HBV基因組的原始復(fù)制模板,是HBV持續(xù)感染的關(guān)鍵因素。HBV的病毒學(xué)特性是影響其感染轉(zhuǎn)歸和抗病毒療效的最根本的原因,HBV cccDNA雖然量少,但十分穩(wěn)定,是HBV慢性感染以及抗病毒藥物停用后病情反復(fù)的主要因素。所以對cccDNA的檢測便成為了解HBV能否在體內(nèi)繼續(xù)復(fù)制的重要環(huán)節(jié),國內(nèi)外學(xué)者設(shè)計和建立了一些HBV cccDNA的檢測方法,通過各種PCR技術(shù)、滾環(huán)擴增(rolling circle amplification, RCA)等實驗室手段能夠?qū)BMCs中的cccDNA進行定性及定量檢測。 近年核苷(酸)類抗病毒藥物的廣泛長期使用帶來了棘手的耐藥問題,已成為臨床抗病毒療效欠佳或失敗的主要原因。關(guān)于臨床上經(jīng)核苷(酸)類似物治療并產(chǎn)生耐藥突變的慢性乙型肝炎患者PBMCs中HBV cccDNA是否同樣存在類似的耐藥突變特點及其是否具有復(fù)制潛能,尚未見相關(guān)研究報道。本研究利用核苷(酸)類藥物選擇作用下產(chǎn)生的特定耐藥突變作為分子標(biāo)簽,重點比較分析了樣本血清HBV DNA和PBMCs HBV cccDNA RT區(qū)耐藥相關(guān)突變的差異以及對PBMCs中HBVcccDNA復(fù)制力進行測定,研究結(jié)果將有助于理解HBV肝外感染及耐藥相關(guān)機制。 目的分析經(jīng)核苷(酸)類似物抗病毒治療并已在血清病毒中產(chǎn)生耐藥突變的慢性乙型肝炎患者PBMCs由HBV cccDNA的基因突變特點及其是否具有復(fù)制表達能力。 方法檢測分析了30例慢性乙型肝炎患者,均經(jīng)6個月以上的核苷(酸)類似物抗病毒治療并已在血清中產(chǎn)生耐藥突變。采集與血清檢測同一時間點的全血標(biāo)本30例并分離PBMCs,提取總DNA,以不降解質(zhì)粒的ATP依賴的DNA酶(Plasmid-SafeTM ATP-dependent DNase, PSAD)消化+滾環(huán)擴增+跨缺口PCR方法擴增HBV cccDNA的RT區(qū),分析rtM204I、rtM204V、rtN236T、rtA181V、rt184、rt202或rt250等多個位點的核苷(酸)類似物耐藥相關(guān)突變。另外將擴增的PBMCs中HBV cccDNA全長基因組克隆到pGEM-Teasy載體中,經(jīng)BspQ Ⅰ/Sca Ⅰ雙酶切釋放的1.0倍HBVcccDNA全長基因組純化后,轉(zhuǎn)染入HepG2肝癌細(xì)胞,72小時后定量檢測HBsAg及核心顆粒DNA,分析PBMCs中HBV cccDNA全長基因組的自然復(fù)制力。 結(jié)果30例樣品中16例檢出HBV cccDNA,檢出率為53.3%,且PBMCs中HBV cccDNA檢出率與HBeAg陽性率、血清ALT水平及血清HBV DNA載量均無顯著相關(guān)性。在16例HBV cccDNA檢出者中,B基因型5例,占31.3%；C基因型11例,占68.8%,與用血清HBV檢測分型結(jié)果一致；但與血清HBV均檢出耐藥突變不同,16例PBMCs cccDNA中檢出的病毒均是無核苷(酸)類似物耐藥突變的野生株。4例慢性乙肝患者中有3例從PBMCs中成功獲得全長cccDNA基因組的6條克隆進行復(fù)制力檢測,通過ELISA法檢測上清HBsAg及實時定量PCR檢測核心顆粒DNA水平,表明其具有復(fù)制表達能力。 結(jié)論經(jīng)核苷酸類似物抗病毒治療的慢乙肝患者血清中HBV DNA產(chǎn)生耐藥突變的情況下,PBMCs中HBV cccDNA仍以原始野生株為優(yōu)勢種群,且轉(zhuǎn)染入體外細(xì)胞的HBV cccDNA證明可以完成復(fù)制周期,即PBMCs中的cccDNA具有復(fù)制表達能力,推測PBMCs可能為體內(nèi)HBV野生株的一個“存儲庫”,并通過cccDNA的形式穩(wěn)定保存HBV的原始野生株。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R512.62

【參考文獻】

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1 宋閩寧,駱梅蘭,黃文琪;乙肝病毒攜帶者外周血單個核細(xì)胞培養(yǎng)上清液HBV-DNA定量檢測意義[J];中國醫(yī)師雜志;2003年04期

2 趙克開,繆曉輝;乙型肝炎病毒cccDNA檢測的方法與臨床意義[J];中華肝臟病雜志;2005年04期

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本文編號：2666736