【摘要】：已有研究支持乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)存在感染患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)等肝外組織的現(xiàn)象,并且在其中檢測(cè)到乙型肝炎病毒抗原及HBV DNA的復(fù)制。HBV共價(jià)閉合環(huán)狀DNA (covalently closed circular DNA, cccDNA)作為HBV基因組的原始復(fù)制模板,是HBV持續(xù)感染的關(guān)鍵因素。HBV的病毒學(xué)特性是影響其感染轉(zhuǎn)歸和抗病毒療效的最根本的原因,HBV cccDNA雖然量少,但十分穩(wěn)定,是HBV慢性感染以及抗病毒藥物停用后病情反復(fù)的主要因素。所以對(duì)cccDNA的檢測(cè)便成為了解HBV能否在體內(nèi)繼續(xù)復(fù)制的重要環(huán)節(jié),國(guó)內(nèi)外學(xué)者設(shè)計(jì)和建立了一些HBV cccDNA的檢測(cè)方法,通過(guò)各種PCR技術(shù)、滾環(huán)擴(kuò)增(rolling circle amplification, RCA)等實(shí)驗(yàn)室手段能夠?qū)BMCs中的cccDNA進(jìn)行定性及定量檢測(cè)。 近年核苷(酸)類(lèi)抗病毒藥物的廣泛長(zhǎng)期使用帶來(lái)了棘手的耐藥問(wèn)題,已成為臨床抗病毒療效欠佳或失敗的主要原因。關(guān)于臨床上經(jīng)核苷(酸)類(lèi)似物治療并產(chǎn)生耐藥突變的慢性乙型肝炎患者PBMCs中HBV cccDNA是否同樣存在類(lèi)似的耐藥突變特點(diǎn)及其是否具有復(fù)制潛能,尚未見(jiàn)相關(guān)研究報(bào)道。本研究利用核苷(酸)類(lèi)藥物選擇作用下產(chǎn)生的特定耐藥突變作為分子標(biāo)簽,重點(diǎn)比較分析了樣本血清HBV DNA和PBMCs HBV cccDNA RT區(qū)耐藥相關(guān)突變的差異以及對(duì)PBMCs中HBVcccDNA復(fù)制力進(jìn)行測(cè)定,研究結(jié)果將有助于理解HBV肝外感染及耐藥相關(guān)機(jī)制。 目的分析經(jīng)核苷(酸)類(lèi)似物抗病毒治療并已在血清病毒中產(chǎn)生耐藥突變的慢性乙型肝炎患者PBMCs由HBV cccDNA的基因突變特點(diǎn)及其是否具有復(fù)制表達(dá)能力。 方法檢測(cè)分析了30例慢性乙型肝炎患者,均經(jīng)6個(gè)月以上的核苷(酸)類(lèi)似物抗病毒治療并已在血清中產(chǎn)生耐藥突變。采集與血清檢測(cè)同一時(shí)間點(diǎn)的全血標(biāo)本30例并分離PBMCs,提取總DNA,以不降解質(zhì)粒的ATP依賴(lài)的DNA酶(Plasmid-SafeTM ATP-dependent DNase, PSAD)消化+滾環(huán)擴(kuò)增+跨缺口PCR方法擴(kuò)增HBV cccDNA的RT區(qū),分析rtM204I、rtM204V、rtN236T、rtA181V、rt184、rt202或rt250等多個(gè)位點(diǎn)的核苷(酸)類(lèi)似物耐藥相關(guān)突變。另外將擴(kuò)增的PBMCs中HBV cccDNA全長(zhǎng)基因組克隆到pGEM-Teasy載體中,經(jīng)BspQ Ⅰ/Sca Ⅰ雙酶切釋放的1.0倍HBVcccDNA全長(zhǎng)基因組純化后,轉(zhuǎn)染入HepG2肝癌細(xì)胞,72小時(shí)后定量檢測(cè)HBsAg及核心顆粒DNA,分析PBMCs中HBV cccDNA全長(zhǎng)基因組的自然復(fù)制力。 結(jié)果30例樣品中16例檢出HBV cccDNA,檢出率為53.3%,且PBMCs中HBV cccDNA檢出率與HBeAg陽(yáng)性率、血清ALT水平及血清HBV DNA載量均無(wú)顯著相關(guān)性。在16例HBV cccDNA檢出者中,B基因型5例,占31.3%；C基因型11例,占68.8%,與用血清HBV檢測(cè)分型結(jié)果一致；但與血清HBV均檢出耐藥突變不同,16例PBMCs cccDNA中檢出的病毒均是無(wú)核苷(酸)類(lèi)似物耐藥突變的野生株。4例慢性乙肝患者中有3例從PBMCs中成功獲得全長(zhǎng)cccDNA基因組的6條克隆進(jìn)行復(fù)制力檢測(cè),通過(guò)ELISA法檢測(cè)上清HBsAg及實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)核心顆粒DNA水平,表明其具有復(fù)制表達(dá)能力。 結(jié)論經(jīng)核苷酸類(lèi)似物抗病毒治療的慢乙肝患者血清中HBV DNA產(chǎn)生耐藥突變的情況下,PBMCs中HBV cccDNA仍以原始野生株為優(yōu)勢(shì)種群,且轉(zhuǎn)染入體外細(xì)胞的HBV cccDNA證明可以完成復(fù)制周期,即PBMCs中的cccDNA具有復(fù)制表達(dá)能力,推測(cè)PBMCs可能為體內(nèi)HBV野生株的一個(gè)“存儲(chǔ)庫(kù)”,并通過(guò)cccDNA的形式穩(wěn)定保存HBV的原始野生株。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類(lèi)號(hào)】：R512.62

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 宋閩寧,駱梅蘭,黃文琪;乙肝病毒攜帶者外周血單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)上清液HBV-DNA定量檢測(cè)意義[J];中國(guó)醫(yī)師雜志;2003年04期

2 趙克開(kāi),繆曉輝;乙型肝炎病毒cccDNA檢測(cè)的方法與臨床意義[J];中華肝臟病雜志;2005年04期

3 吳鳳婷;呂其軍;;肝病患者血清中HBVcccDNA檢測(cè)的臨床意義[J];肝臟;2007年04期

，

本文編號(hào)：2666736