【摘要】：【背景】 原發(fā)性膽汁性肝硬化（Primary biliary cirrhosis，PBC）是一種由自身免疫反應(yīng)介導(dǎo)的、以肝內(nèi)小膽管進(jìn)行性破壞性、非化膿性炎癥為特點(diǎn)的慢性肝內(nèi)膽汁淤積性疾病，病程呈進(jìn)行性，可發(fā)展至肝纖維化、肝硬化。近年來，由于對(duì)PBC認(rèn)識(shí)程度和疾病診斷水平的提高，PBC檢出率呈現(xiàn)逐年增高的趨勢，作為非病毒性肝病，PBC的危害不容忽視。目前認(rèn)為，PBC發(fā)病是遺傳因素與環(huán)境因素相互作用的結(jié)果，但具體機(jī)制仍未闡明。由于PBC病人多表現(xiàn)為膽汁排泄障礙，我們嘗試從膽汁排泄角度入手尋找與PBC發(fā)病相關(guān)的新分子。 肝細(xì)胞是一種極性細(xì)胞，其膽管側(cè)細(xì)胞膜上存在著多種特異性表達(dá)分布的酶、骨架蛋白、通道蛋白、離子交換體和轉(zhuǎn)運(yùn)體，共同參與肝細(xì)胞物質(zhì)運(yùn)輸及膽汁排泄。有研究顯示，PBC患者肝細(xì)胞膽管側(cè)細(xì)胞膜極性分子存在結(jié)構(gòu)和功能異常。 1F9單克隆抗體是本課題組前期以PBC患者肝細(xì)胞膽管側(cè)膜性組分為免疫原，利用單克隆抗體技術(shù)篩選獲得的PBC相關(guān)單克隆抗體之一。前期研究發(fā)現(xiàn)，該單抗所識(shí)別的抗原在正常肝臟組織中呈極性分布，主要位于肝細(xì)胞膽管側(cè)；PBC患者肝臟組織中1F9抗原的表達(dá)隨疾病進(jìn)展逐漸增強(qiáng)，且部分患者中1F9抗原極性消失、分布紊亂，提示1F9抗原可能對(duì)PBC病理診斷具有重要意義。由于對(duì)1F9抗原認(rèn)識(shí)有限，很大程度上限制了后續(xù)深入研究。因此，本研究擬在前期研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步明確1F9抗原與PBC的相關(guān)性，分離并鑒定1F9抗原，為后續(xù)機(jī)制研究奠定理論基礎(chǔ)。 【目的】 1、進(jìn)一步明確1F9抗原與PBC的相關(guān)性；2、分離、鑒定1F9抗原。 【方法】 1、采用免疫組織化學(xué)，研究1F9抗原在正常肝臟、PBC、乙型病毒性肝炎、藥物性肝病、酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝病，共6種肝臟組織標(biāo)本中的表達(dá)與分布，進(jìn)一步明確1F9抗原與PBC的相關(guān)性。 2、檢測并分析1F9單抗亞型，輕、重鏈可變區(qū)序列及二級(jí)空間結(jié)構(gòu)；采用蛋白組學(xué)技術(shù)包括免疫沉淀、SDS-PAGE凝膠電泳和質(zhì)譜分析（MALDI-TOF-TOF及LC-MS/MS），分離、鑒定1F9候選抗原。 3、通過免疫沉淀產(chǎn)物Western blot分析，驗(yàn)證1F9單抗與LAMP2單抗對(duì)對(duì)方抗原的交叉識(shí)別；通過連續(xù)組織切片免疫組化檢測，觀察1F9抗原與LAMP2在多種正常組織及PBC疾病組織中的表達(dá)與分布；通過免疫熒光/激光共聚焦，觀察1F9抗原與LAMP2在細(xì)胞中的共定位情況；通過真核表達(dá)系統(tǒng)，觀察1F9單抗對(duì)外源LAMP2蛋白的識(shí)別；通過免疫電鏡技術(shù)，觀察1F9抗原與LAMP2在正常肝臟及PBC疾病狀態(tài)下的亞細(xì)胞定位。 【結(jié)果】 1、對(duì)來源于2006年至2012年第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院病理科的正常肝臟組織32例、PBC174例、乙型病毒性肝炎87例、藥物性肝病44例、酒精性肝病23例、非酒精性脂肪性肝病53例，共6種石蠟包埋的肝臟組織標(biāo)本進(jìn)行切片、染色，觀察1F9抗原在不同肝臟組織中的表達(dá)與分布。免疫組化結(jié)果顯示，正常肝臟中，1F9抗原呈極性分布，主要位于肝細(xì)胞膽管側(cè)；無膽汁淤積的肝臟疾病（乙型病毒性肝炎、藥物性肝病、酒精性肝病和非酒精性脂肪性肝病）中，1F9抗原的表達(dá)與正常肝臟無明顯變化；PBC患者肝臟中，1F9抗原的表達(dá)隨疾病進(jìn)展逐漸增強(qiáng)，約51%（88/174）的患者中1F9抗原呈現(xiàn)不同程度地分布紊亂、極性消失，彌漫性分布于肝細(xì)胞胞漿中，提示1F9抗原與PBC密切相關(guān)。 2、1F9單抗亞型為IgG1/κ，輕、重鏈可變區(qū)序列及二級(jí)結(jié)構(gòu)已明確。肝癌細(xì)胞系HepG2和腎小管上皮細(xì)胞系HK2中1F9抗原呈陽性表達(dá)。選擇HepG2和HK2兩株細(xì)胞系，利用1F9單抗進(jìn)行免疫沉淀富集1F9抗原，免疫沉淀產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳分離后分別進(jìn)行銀染和Western blot驗(yàn)證。銀染結(jié)果顯示，兩株細(xì)胞系中均成功富集到~110kDa的蛋白帶，Western blot證實(shí)該蛋白帶可被1F9單抗特異性識(shí)別。分別對(duì)兩株細(xì)胞系中富集到的~110kDa蛋白帶進(jìn)行切膠、酶解，同時(shí)利用兩種質(zhì)譜分析方法MALDI-TOF-TOF和LC-MS/MS進(jìn)行檢測，通過生物信息學(xué)檢索，結(jié)合分子量、組織分布等信息，獲得1F9候選抗原Lysosome-associated membraneglycoprotein2（LAMP2）。 3、經(jīng)鑒定，現(xiàn)已明確1F9抗原為LAMP2：①HepG2和HK2兩株細(xì)胞系中，1F9單抗免疫沉淀的蛋白可被1F9單抗、LAMP2單抗特異性識(shí)別，而不能被LAMP1（LAMP1為LAMP2同源分子）單抗識(shí)別；同時(shí)，LAMP2單抗免疫沉淀的蛋白也可被1F9單抗、LAMP2單抗特異性識(shí)別，且不能被LAMP1單抗識(shí)別；②免疫組化結(jié)果顯示，1F9抗原和LAMP2在多種連續(xù)正常組織及PBC組織中的表達(dá)、分布相似；③免疫熒光/激光共聚焦結(jié)果證實(shí)，HepG2和HK2細(xì)胞系中，1F9抗原與LAMP2呈現(xiàn)良好的共定位現(xiàn)象；④犬腎上皮細(xì)胞系MDCK中1F9抗原和LAMP2均不表達(dá)，分別將LAMP1質(zhì)粒和LAMP2質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染MDCK細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白進(jìn)行Western blot分析，結(jié)果顯示1F9單抗可以識(shí)別外源表達(dá)的LAMP2蛋白，而不能識(shí)別外源表達(dá)的LAMP1蛋白；⑤免疫電鏡結(jié)果顯示，正常肝臟中，1F9抗原與LAMP2定位相似，主要分布于肝細(xì)胞膽管側(cè)細(xì)胞膜附近的囊泡膜，囊泡直徑大小從50至400納米不等；PBC患者肝組織中，LAMP2表達(dá)增強(qiáng)、分布紊亂的特點(diǎn)也與1F9抗原相似，具體表現(xiàn)為：PBC中，囊泡數(shù)量明顯增多，標(biāo)記有膠體金顆粒的囊泡彌漫性分布于整個(gè)細(xì)胞漿，且膠體金顆粒除分布于囊泡膜外，囊泡腔內(nèi)也出現(xiàn)膠體金顆粒聚集，同時(shí)，肝細(xì)胞胞漿內(nèi)還存在一部分與囊泡毫無關(guān)系的可溶性LAMP2分子（散在分布的膠體金顆粒）。 【結(jié)論】 本研究進(jìn)一步證實(shí)了1F9抗原與PBC的相關(guān)性：①PBC患者肝臟中，1F9抗原表達(dá)增強(qiáng)；②1F9抗原表達(dá)增強(qiáng)與PBC病理分級(jí)正相關(guān)；③51%（88/174）的PBC患者肝臟中，1F9抗原呈現(xiàn)不同程度地分布紊亂、極性消失。 本研究明確了1F9單抗亞型，輕、重鏈可變區(qū)序列及二級(jí)空間結(jié)構(gòu)，并最終證實(shí)1F9抗原為LAMP2：①通過免疫沉淀——質(zhì)譜分析（MALDI-TOF-TOF及LC-MS/MS方法）策略，獲得1F9候選抗原LAMP2；②通過免疫沉淀產(chǎn)物Western blot分析，證實(shí)1F9單抗與LAMP2單抗可以相互識(shí)別對(duì)方抗原；③通過連續(xù)組織切片免疫組化檢測，證實(shí)1F9抗原與LAMP2在多種正常組織和PBC疾病組織中的表達(dá)、分布一致；④通過免疫熒光/激光共聚焦，證實(shí)1F9抗原與LAMP2在細(xì)胞系中共定位良好；⑤通過LAMP2真核表達(dá)產(chǎn)物Western blot分析，證實(shí)1F9單抗可以識(shí)別外源表達(dá)的LAMP2蛋白；⑥通過免疫電鏡技術(shù)，證實(shí)1F9抗原與LAMP2在正常肝臟組織及PBC疾病狀態(tài)下的亞細(xì)胞定位相似。
【圖文】：

內(nèi)體在上皮細(xì)胞極性形成中起重要作用[42]另有研究顯示，內(nèi)體與肝細(xì)胞膽汁排泄密切相關(guān)。HepG2 細(xì)胞中，，SAC 通過不同的運(yùn)輸通路，參與神經(jīng)鞘脂類似物[C6NBD-sphingomylin(SM)、C6NBD-glucosylceramide (GlcCer)]向頂端膜運(yùn)輸，進(jìn)而參與頂端膜形成[29]。其次，BSEP 和 MRP2 是肝細(xì)胞頂端膜中與膽汁排泄密切相關(guān)的 ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)體，WIF-B9 細(xì)胞極性形成過程中，rab11a 陽性循環(huán)內(nèi)體不僅參與頂端膜形成，并且通過介導(dǎo) BSEP 和 MRP2 向頂端膜運(yùn)輸，影響膽汁排泄[43]。（三）、肝細(xì)胞膽管側(cè)極性分子異常與多種膽汁淤積性疾病密切相關(guān)肝細(xì)胞膽管側(cè)極性分子異常與多種膽汁淤積性疾病密切相關(guān)（見表 2），如：進(jìn)行性家族性肝內(nèi)膽汁淤積癥 1-3 型（PFIC1-3）、原發(fā)性膽汁性肝硬化（PBC）、原發(fā)性硬化性膽管炎（PSC）、Dubin Johnson 綜合癥、Wilson 氏

第四軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文示肝外膽汁淤積引起肝細(xì)胞 AQP8 轉(zhuǎn)錄后蛋白水平下調(diào)[75]。同時(shí)，敗血癥相關(guān)膽汁淤積癥（Sepsis-associated cholestasis）大鼠中，AQP8 蛋白表達(dá)下降，也出現(xiàn) AQP8 mRNA 表達(dá)水平反應(yīng)性增高現(xiàn)象[76]。對(duì)于敗血癥相關(guān)膽汁淤積癥的發(fā)病機(jī)制[77, 78]，有研究認(rèn)為細(xì)菌脂多糖（Lipopolysaccharides ，LPS）誘導(dǎo)肝臟 Kupffer 細(xì)胞釋放 TNFα等炎性細(xì)胞因子，繼而通過誘導(dǎo)溶酶體和蛋白酶體對(duì) AQP8 的降解實(shí)現(xiàn)對(duì) AQP8 的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控（圖 2）。
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R575.2

【共引文獻(xiàn)】

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1 羅紅春;梅浙川;;原發(fā)性膽汁性肝硬化的治療進(jìn)展[J];國際消化病雜志;2008年01期

2 張波;張余芬;;原發(fā)性膽汁性肝硬化的免疫學(xué)特點(diǎn)及治療進(jìn)展[J];海南醫(yī)學(xué);2011年07期

3 劉葵花,趙秀華,寧志杰,汪明明;皮膚瘙癢、黃疸、左眼上瞼黃色疣、肝功能異常[J];臨床薈萃;2004年02期

4 張波;陸雁;曹弘;胡泰紅;;原發(fā)性膽汁性肝硬化的治療進(jìn)展及誤診原因分析[J];臨床肝膽病雜志;2010年04期

5 唐清;王琳琳;王華;單慶文;;多藥耐藥蛋白3和法尼醇受體在嬰兒膽汁淤積性肝炎肝組織中的表達(dá)及意義[J];實(shí)用兒科臨床雜志;2011年07期

6 唐清;王琳琳;王華;單慶文;;多藥耐藥蛋白3在嬰兒肝外膽道閉鎖和巨細(xì)胞病毒性肝炎肝組織的表達(dá)及其意義[J];中國實(shí)用兒科雜志;2011年09期

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1 唐清;肝細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)及ABCB4基因突變?cè)趮雰耗懼俜e性肝炎發(fā)病機(jī)制中的探討[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2011年

2 史旭華;原發(fā)性膽汁性肝硬化的臨床與基礎(chǔ)研究及對(duì)治療的反應(yīng)[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2006年

3 劉斌;原發(fā)性膽汁性肝硬化發(fā)病機(jī)制研究及藥物治療探索[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2008年

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1 曹云海;利福平對(duì)小鼠肝細(xì)胞膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)體Bsep和Mrp2表達(dá)與定位的影響[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2011年

2 田世媛;原發(fā)性膽汁性肝硬化合并自身免疫性疾病患者外周血免疫指標(biāo)變化的分析[D];大連醫(yī)科大學(xué);2011年

3 喬麗娟;利用家系相關(guān)性分析方法探討原發(fā)性膽汁性肝硬化的基因易感性[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2010年

本文編號(hào)：2666590