發(fā)布時(shí)間：2020-05-15 11:52

【摘要】：肝纖維化是所有慢性肝病發(fā)生發(fā)展的共同病理基礎(chǔ)和病理特征。肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell, HSC)在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中起到了關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)含RGD結(jié)構(gòu)的環(huán)形多肽能與HSC表面的Ⅵ型膠原受體特異性結(jié)合。小異二聚體(SHP,一種核受體),作為法呢醇X受體-小異二聚體(FXR-SHP)調(diào)控酶鏈上的關(guān)鍵環(huán)節(jié),在細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)時(shí)可促進(jìn)活化HSC轉(zhuǎn)變?yōu)殪o止表型并促進(jìn)其凋亡而發(fā)揮抗纖維化作用。聚乙烯亞胺(PEI)是近年來發(fā)展較快的陽離子聚合物非病毒載體,對(duì)它進(jìn)行聚乙二醇修飾(PEG化)后可以提高溶解性,減小細(xì)胞毒性以及延長體內(nèi)循環(huán)時(shí)間。 本研究的主要目的是構(gòu)建肝星狀細(xì)胞(HSC)的特異性靶向陽離子聚合物載體RGD-PEG-PEI,攜帶SHP基因,通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)RGD-PEG-PEI/SHP的抗纖維化作用并探討可能的作用機(jī)制。 本研究的主要內(nèi)容包括：RGD(Arg-Gly-Asp)環(huán)肽修飾PEG化聚乙烯亞胺作為基因遞釋載體的研究；RGD-PEG-PEI/SHP復(fù)合物對(duì)活化肝星狀細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效果的研究；RGD-PEG-PEI/SHP復(fù)合物對(duì)大鼠肝纖維化的治療效果的研究。 第一部分RGD(Arg-Gly-Asp)環(huán)肽修飾PEG化聚乙烯亞胺作為基因遞釋載體的研究 目的：研究RGD環(huán)肽修飾PEG化聚乙烯亞胺修飾作為基因治療載體的制備過程及其理化性質(zhì),建立一個(gè)能攜帶質(zhì)粒DNA的HSC特異性靶向基因治療載體系統(tǒng)。 方法：選用美國Nektar公司的產(chǎn)品NHS-PEG-MAL,它具有雙功能基團(tuán),利用NHS和MAL基團(tuán)不同反應(yīng)活性的特點(diǎn),使用簡單的化學(xué)加成反應(yīng)制備RGD-PEG-PEI復(fù)合物,利用質(zhì)譜分析的方法鑒定產(chǎn)物并計(jì)算反應(yīng)效率；SHP-pEGFP真核表達(dá)載體的構(gòu)建并合成不同氮磷比(N/P)的RGD-PEG-PEI/SHP復(fù)合物,通過凝膠電泳阻滯分析復(fù)合物的包封率,粒度/zeta電位測定儀測定復(fù)合物的粒徑和帶電情況,MTT法測定其細(xì)胞毒性。 結(jié)果：NHS-PEG-MAL的兩個(gè)活性集團(tuán)分別和RGD、PEI連接,質(zhì)譜分析法證明反應(yīng)成功和完全；1％RGD-PEG-PEI/SHP復(fù)合物的包封率在99%以上,粒徑在157nm-160nm之間,隨著復(fù)合物N/P的增加,粒徑有減小的趨勢而zeta電位有增加的趨勢；1%RGD-PEG-PEI/SHP復(fù)合物細(xì)胞毒性在不同N/P比值上都顯著低于PEI/DNA(P0.01)。 結(jié)論：成功地構(gòu)建了具有RGD多肽靶向功能的PEG修飾的SHP基因聚乙烯亞胺治療載體；對(duì)1%RGD-PEG-PEI/SHP復(fù)合物性質(zhì)考察證明它包封率高,粒徑和電位穩(wěn)定且細(xì)胞毒性低。 第二部分RGD-PEG-PEI/SHP復(fù)合物對(duì)活化肝星狀細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效果評(píng)價(jià) 目的：比較1％RGD-PEG-PEI/SHP、PEG-PEI/SHP、PEI/SHP和SHP不同復(fù)合物對(duì)活化的大鼠HSC的靶向作用和抗纖維化作用。 方法：鏈霉蛋白酶E/Ⅳ型膠原酶灌注——梯度離心的方法從正常雄性SD大鼠(400-450g,14周齡)肝臟分離HSC,培養(yǎng)并傳代：通過流式細(xì)胞儀檢測綠色熒光蛋白報(bào)告基因表達(dá)評(píng)價(jià)體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率；熒光定量實(shí)時(shí)PCR(qRT-PCR)比較轉(zhuǎn)染后HSC內(nèi)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)、α1(Ⅰ)型前膠原(α1(Ⅰ)procollagen)、組織金屬蛋白酶抑制物—1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1,TIMP-1)、TIMP-2、基質(zhì)金屬蛋白酶—2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)、轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)的mRNA表達(dá)的變化情況：Western Blot比較α-SMA和Ⅰ型膠原生成的變化情況。 結(jié)果：流式細(xì)胞儀檢測1%RGD-PEG-PEI/SHP組轉(zhuǎn)染活化肝星狀細(xì)胞后的熒光強(qiáng)度明顯高于其它各治療組(P0.01)；1%RGD-PEG-PEI/SHP轉(zhuǎn)染活化大鼠肝星狀細(xì)胞后SHP mRNA水平和各組比明顯升高(P0.01),同時(shí)細(xì)胞內(nèi)α-SMA、TIMP-1、TIMP-2、TGF-β1和α1(Ⅰ)procollagen mRNA水平都有下降(P0.01),MMP-2 mRNA水平?jīng)]有變化(P0.05)；1％RGD-PEG-PEI/SHP組的SHP表達(dá)顯著提高(P0.01),α-SMA和Ⅰ型膠原的表達(dá)和各組比均顯著降低(P0.01)。 結(jié)論：1％RGD-PEG-PEI/SHP組對(duì)活化HSC的轉(zhuǎn)染效率顯著提高；SHP mRNA表達(dá)明顯升高,致肝纖維化的α-SMA、TGF-β1、α1(Ⅰ)procollagen、TIMP-1、TIMP-2基因的mRNA表達(dá)下降,MMP-2的mRNA表達(dá)沒有變化；α-SMA和Ⅰ型膠原的生成明顯減少。 第三部分RGD-PEG-PEI/SHP復(fù)合物對(duì)大鼠肝纖維化的治療效果 目的：評(píng)價(jià)1%RGD-PEG-PEI/SHP對(duì)大鼠肝纖維化的治療作用及其作用機(jī)制研究。 方法：腹腔注射硫代乙酰胺(TAA)10周誘導(dǎo)大鼠出現(xiàn)肝纖維化。肝纖維化大鼠分成五組(n=8)：1%RGD-PEG-PEI/SHP、PEG-PEI/SHP、PEI/SHP:SHP和生理鹽水對(duì)照。每組第3和第6周各注射一次相應(yīng)的復(fù)合物一次。比較每組的肝臟病理分期、α-SMA陽性細(xì)胞凋亡率和抗纖維化各基因mRNA的表達(dá)情況。 結(jié)果：與其他組相比,注射1%RGD-PEG-PEI/SHP后大鼠肝纖維化明顯緩解,纖維化分期和炎癥分級(jí)評(píng)分與各組比明顯降低(P0.01)；1%RGD-PEG-PEI/SHP誘導(dǎo)的α-SMA陽性細(xì)胞凋亡率顯著升高(P0.01)；1%RGD-PEG-PEI/SHP組治療后大鼠肝組織中α-SMA、TIMP-1、TIMP-2、TGF-β1和α1 (Ⅰ) procollagenmRNA的表達(dá)和各組比下降明顯(P0.01)；MMP-2 mRNA的表達(dá)沒有明顯變化(P0.05)。 結(jié)論：1%RGD-PEG-PEI/SHP在大鼠纖維化模型中通過誘導(dǎo)α-SMA陽性細(xì)胞凋亡、下調(diào)肝纖維化基因表達(dá)等促進(jìn)肝纖維化逆轉(zhuǎn),發(fā)揮靶向抗肝纖維化作用。
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R575.2

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本文編號(hào)：2664983