發(fā)布時間：2020-05-14 09:21

【摘要】： 潰瘍性結(jié)腸炎(UC)是一種病因不明的慢性腸道非特異性炎癥性疾病,發(fā)病機制不詳,一般認(rèn)為是由包括感染在內(nèi)的環(huán)境因素作用于具有多個基因缺陷的易感傾向個體,誘發(fā)異常免疫反應(yīng)而導(dǎo)致疾病。西方國家發(fā)病率較高,亞洲發(fā)病率較低,但是近年來國內(nèi)發(fā)病率逐年攀升。既往的流行病學(xué)研究顯示UC具有遺傳易感性,主要在不同人種的發(fā)病率、家族聚集現(xiàn)象、雙生子的研究中得到證實。近年來,基因連鎖分析確定了多個IBD易感基因的染色體座位,被稱為IBD1-IBD7;進(jìn)而,發(fā)現(xiàn)了多個UC的易感基因,并在不同人群中得到證實,例如SLC22A4和SLC22A5基因的多態(tài)性與CD和UC均有相關(guān)性,在意大利人群和英格蘭高加索人群中相繼得到重復(fù)。但是,UC是一個多基因遺傳疾病,其基因型與臨床表型之間存在紛繁復(fù)雜的關(guān)系;并且由于遺傳異質(zhì)性的存在,特別是東西方人群之間的差異,很多西方的研究成果在東方無法得到重復(fù),因此,尋找具有普遍性的IBD易感基因無可避免地成為目前研究的方向。 近年來RUNX結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子家族成員與自身免疫性疾病的相關(guān)性開始引起關(guān)注,nature genetics雜志相繼報道了與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病及系統(tǒng)性紅斑狼瘡相關(guān)的易感基因,這些基因SNP位點的共同特征是均位于Runx1蛋白的結(jié)合區(qū),從中我們可以看出自身免疫紊亂的表象下面蘊含著共同的分子機制,Runxs蛋白家族成員在自身免疫性疾病的發(fā)病機制中可能均發(fā)揮著重要作用。RUNX3是Runt結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子家族成員,位于染色體1P36.1,對炎癥性腸病的特定易感人群的研究發(fā)現(xiàn)其染色體1P36存在基因緊密連鎖和連鎖不平衡現(xiàn)象。另外,Ori Brenner等人在研究中發(fā)現(xiàn)RUNX3基因敲除小鼠在4周齡時均自發(fā)發(fā)生潰瘍性結(jié)腸炎。這些均提示RUNX3在潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病機制中可能具有重要作用,但是RUNX3及其直接調(diào)控的下游基因的基因多態(tài)性是否與潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)還不明確,本課題將對此進(jìn)行探討。 目的: 1、明確RUNX3的表達(dá)與潰瘍性結(jié)腸炎是否相關(guān);2、篩選RUNX3調(diào)控的下游基因,預(yù)期從中找出與潰瘍性結(jié)腸炎易感性密切相關(guān)基因;3、檢測我國漢族人群中RUNX3及其下游基因的多態(tài)性與UC的相關(guān)性。 方法: 1、收集68例UC患者病變部位結(jié)腸粘膜組織及50例結(jié)腸癌患者手術(shù)后標(biāo)本兩端的正常粘膜組織,用免疫組織化學(xué)方法檢測RUNX3在結(jié)腸粘膜組織中的表達(dá)情況。2、通過染色質(zhì)免疫共沉淀-啟動子芯片(CHIP-chip)技術(shù)篩選RUNX3調(diào)控的下游基因,從中找出與潰瘍性結(jié)腸炎易感性密切相關(guān)基因;3、采用PCR-SSP技術(shù),對80例UC患者以及153例健康對照的RUNX3基因(rs2236851,C/T)、SLC22A4(rs3792876,C/T)及PPAR-γ(rs3892175,A/G)的遺傳多態(tài)性進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)統(tǒng)計使用SPSS軟件進(jìn)行χ2檢驗分析。 結(jié)果: 1、利用免疫組化技術(shù)檢測了68例UC患者及50例正常粘膜組織中RUNX3的表達(dá),發(fā)現(xiàn)RUNX3在潰瘍性結(jié)腸炎患者的腸粘膜中的表達(dá)陽性率為76.5% (52/68),對照組粘膜的陽性率為66.0%(33/50),經(jīng)過χ2檢驗進(jìn)行比較,UC組與對照組間無顯著差別(P0.05),且RUNX3的表達(dá)與UC患者的性別、年齡、病情程度及病變部位無關(guān)。 2、利用染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù),得到SGC7901細(xì)胞中受到RUNX3直接調(diào)控的基因片段,純化后送基因芯片公司,經(jīng)熒光探針的制備、芯片雜交、圖像采集和數(shù)據(jù)分析等步驟,以兩組信號強度的比值大于2作為判定標(biāo)準(zhǔn),結(jié)果得到698個可能受到RUNX3直接調(diào)控的基因。其中PPAR-γ基因與UC的關(guān)系密切,成為我下一步研究關(guān)注對象之一。 3、RUNX3基因rs2236851C/T位點在我國人群中存在遺傳多態(tài)性,UC組T等位基因頻率為18.49%,明顯高于對照組(7.75%),可能與UC相關(guān)(P=0.001)。UC組RUNX3基因型分布為TT型0%,TC型36.99%,CC型63.01% ;對照組為TT型0%,TC型15.49%,CC型84.51%;其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。因此RUNX3的rs2236851位點可能與UC的遺傳易感性相關(guān)。SLC22A4基因(rs3792876C/T)及PPAR-γ基因(rs3892175A/G)在我國人群中存在多態(tài)性,但與UC的發(fā)病無顯著相關(guān)。 結(jié)論: 本研究發(fā)現(xiàn)①RUNX3在潰瘍性結(jié)腸炎患者的腸粘膜中的表達(dá)與對照組相比無顯著差別,但RUNX3基因rs2236851C/T位點在我國人群中存在遺傳多態(tài)性,且與我國漢族人群UC的發(fā)病有相關(guān)性。②SLC22A4基因(rs3792876 C/T)在我國人群中存在多態(tài)性,但與UC的發(fā)病無顯著相關(guān)。③PPAR-γ基因(rs3892175A/G)在我國人群中同樣存在多態(tài)性,但與UC的發(fā)病無顯著相關(guān)。
【圖文】：

圖2 RUNX3 的基因結(jié)構(gòu)（引自Gene，2001）RUNX3 是一個近年新發(fā)現(xiàn)的腫瘤抑制基因，其活性受各種信號通路調(diào)控，磷酸化、乙酰化和遍在蛋白化作用對Runx3 的翻譯后修飾很重要，影響其穩(wěn)定性和活性 。啟動子異常甲基化在RUNX3 基因的表達(dá)調(diào)控、DNA修復(fù)、基因穩(wěn)定及基因抑制方面起著重要作用。啟動子異常甲基化阻礙了轉(zhuǎn)錄因子與DNA之間的相互作用而抑制了轉(zhuǎn)錄，使與細(xì)胞增殖和分化有關(guān)的基因表達(dá)異常，細(xì)胞對正常分化過程的調(diào)節(jié)失控，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。Runt結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子與TGF-β超家族成員共同介導(dǎo)一些重要的生物學(xué)效應(yīng)，TGF-β是一個多功能生長因子，對機體許多生長和生理進(jìn)程有重要的調(diào)控作用，其受體屬于單次跨膜受體，活性TGF-β可以通過與有絲氨酸/蘇氨酸活性激酶的跨膜受體TGF-β受體I和Ⅱ(TβRI和TβRⅡ)結(jié)合，誘導(dǎo)這兩種受體產(chǎn)生活性的異四聚體復(fù)合物(TβRC)，，從而產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)生物效應(yīng)[123]，此過程中Smad蛋白起著重要的作用。TGFβ信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的配體、受體和胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子

2、啟動子芯片結(jié)果經(jīng)染色質(zhì)免疫共沉淀后的樣品，送往北京博奧生物有限公司，經(jīng)過GLAS擴增后，進(jìn)行質(zhì)量鑒定復(fù)合要求（圖2），進(jìn)行芯片雜交、圖像采集、數(shù)據(jù)分析后，以兩組之間信號強度的比值大于2 為判定標(biāo)準(zhǔn)得到698個可能受到RUNX3直接調(diào)控的基因(圖3)；下表列出了其中信號強度排列靠前的25個基因（表1）。其中的PPARγ基因與潰瘍性結(jié)腸炎的關(guān)系密切，值得我們進(jìn)一步研究。lane1：DNA markerlane2：input 樣品lane3：陰性對照樣品lane4：ChIP 產(chǎn)物樣品M 1 2 3070417圖 2、探針擴增后雜交前的電泳圖（質(zhì)量控制）-50-
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R574.62

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2663140