【摘要】：第一部分 不同病理分期大鼠肝纖維化模型的建立 目的： 建立穩(wěn)定的不同病理分期的大鼠肝纖維化動(dòng)物模型,一方面為后期評(píng)估不同病變程度的干細(xì)胞治療效果提供相對(duì)客觀(guān)的受試對(duì)象,另一方面也可使目前國(guó)內(nèi)外眾多肝纖維化動(dòng)物模型建立方法的標(biāo)準(zhǔn)化提供前期研究參考。 材料和方法： 以Sprague-Dawley (SD)大鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,以腹腔注射小劑量四氯化碳(CC14)+飲用乙醇溶液緩慢建立標(biāo)準(zhǔn)化大鼠肝纖維化動(dòng)物模型。分別于建模后第2-15周時(shí)觀(guān)察大鼠的血清透明質(zhì)酸(Hyaluronic Acid, HA)、層粘連蛋白(Laminin, LN)、Ⅲ型前膠原氨端肽(Procollagen Ⅲ N-terminal Peptide, PⅢNP)、Ⅳ型膠原(Collagen Type Ⅳ，CⅣ)及結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(Conective Tissue Growth Factor, CTGF)水平及肝臟病理活組織檢查,按照肝纖維化病理分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)這些動(dòng)物的肝纖維化程度進(jìn)行評(píng)定。 結(jié)果： 通過(guò)小劑量、緩慢、個(gè)體化、聯(lián)合給藥法建模,可以觀(guān)察到造模不同周次與其相對(duì)應(yīng)的血清學(xué)指標(biāo)和不同的病理學(xué)分期存在明確的對(duì)應(yīng)規(guī)律。 結(jié)論： 該方法可標(biāo)準(zhǔn)化地建立S0-S4共5個(gè)肝纖維化病理分期的大鼠模型,且由于采用多種低毒性化學(xué)藥物聯(lián)合造模,在建模的較高成功率(89.33%)的同時(shí)保證了較低死亡率(17.3%)。 第二部分骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外擴(kuò)增及鑒定 目的： 在體外成功地分離、培養(yǎng)和純化Sprague—Dawley(SD)大鼠來(lái)源骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)。 方法： 單純貼壁法分離培養(yǎng)SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,倒置顯微鏡觀(guān)察細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài),流式細(xì)胞學(xué)檢查骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志抗原的表達(dá)情況。 結(jié)果： 培養(yǎng)的BMSCs為多角形或梭形,人小形態(tài)相對(duì)均一,呈漩渦狀排列生長(zhǎng)。流式細(xì)胞學(xué)檢查細(xì)胞表面標(biāo)志抗原CD29、CD71、CD90高表達(dá),而CD11b和CD45低表達(dá)情況。 結(jié)論： 采用單純貼壁法可在體外成功地分離、培養(yǎng)和純化大鼠BMSCs,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究奠定了一部分實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 第三部分CTGF基因RNA干擾慢病毒載體的構(gòu)建與功能鑒定 目的： 通過(guò)相關(guān)檢測(cè)確定可以采用RNA干擾對(duì)大鼠BMSCs進(jìn)行基因修飾后,構(gòu)建CTGF基因RNA干擾慢病毒載體感染大鼠BMSCs并獲得較為穩(wěn)定的細(xì)胞株,實(shí)驗(yàn)過(guò)程中逐步進(jìn)行鑒定。 方法： 首先通過(guò)qPCR方法檢測(cè)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)CTGF基因表達(dá)是否為高水平,以確定下調(diào)CTGF基因的操作方法是否可行。然后用“不同MOI值(Multiplicity of Infection)感染細(xì)胞測(cè)試(將病毒液按MOI=0,2,5,10,20,50,100,200,300加入培養(yǎng)的細(xì)胞,以確定合適的MOI值)”的方法確定慢病毒感染大鼠BMSCs細(xì)胞株最為適合的MOI值；構(gòu)建針對(duì)靶基因的四個(gè)干擾質(zhì)粒(pcDNATM6.2-X147-1、pcDNATM6.2-X147-2, pcDNATM6.2-X147-3、pcDN ATM6.2-X147-4),把這四個(gè)都有特定抗性表達(dá)序列的干擾質(zhì)粒分別與高表達(dá)干擾序列--CTGF的載體(pCDNA3.1(+)-CTGF)共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,選擇出干擾效果最佳的質(zhì)粒,利用BP重組及LR重組的gateway技術(shù),構(gòu)建慢病毒表達(dá)載體；用構(gòu)建的慢病毒表達(dá)載體和包裝質(zhì)粒(packaging mix)共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,包裝病毒,收集病毒原液,超速離心濃縮,并測(cè)定滴度；將得到的同時(shí)有CTGF基因RNA干擾序列、GFP表達(dá)序列及氨芐青霉素抗性表達(dá)序列的慢病毒感染靶細(xì)胞,采用氨芐青霉素等抗性篩選法去除未經(jīng)感染的陰性細(xì)胞。 結(jié)果： 靶基因CTGF有較高的表達(dá)；不同MOI值感染細(xì)胞測(cè)試證實(shí)MOI=200有較好的效果；干擾載體測(cè)序結(jié)果證實(shí)miRNA干擾載體的四個(gè)干擾質(zhì)粒pcDNATM6.2-X147-1、pcDNATM6.2-X147-2、pcDNATM6.2-X147-3、 pcDNATM6.2-X147-4,高表達(dá)載體pCDNA3.1(+)-CTGF,'慢病毒載體pLenti6.3-X147-2,均構(gòu)建成功；干擾載體在HEK293細(xì)胞中的干擾結(jié)果提示pcDNATM6.2-X147-2干擾效果最佳——干擾效率為81%。通過(guò)氨芐青霉素抗性篩選法去除了未經(jīng)感染的細(xì)胞得到經(jīng)CTGF基因RNA干擾慢病毒感染的大鼠BMSCs細(xì)胞株。 結(jié)論： 成功構(gòu)建了大鼠BMSCs細(xì)胞株CTGF基因RNA干擾慢病毒載體Lenti6.3-X147-2,通過(guò)CTGF基因RNA干擾病毒載體感染大鼠BMSCs,得到了穩(wěn)定的靶基因下調(diào)大鼠BMSCs細(xì)胞株。 第四部分CTGF基因RNA干擾慢病毒感染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)大鼠肝纖維化的治療作用 目的： 觀(guān)察CTGF基因RNA干擾慢病毒感染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)大鼠肝纖維化的治療作用以及在不同肝纖維化程度下的治療作用的差異。 方法： 選用健康雄性SD大鼠95只,按照論文第一部分“不同病理分期大鼠肝纖維化模型的構(gòu)建”方法構(gòu)建好動(dòng)物模型,把得到的與時(shí)間依賴(lài)的規(guī)律性肝纖維化按照肝纖維化程度進(jìn)行分級(jí),在各級(jí)的大鼠中隨機(jī)抽取實(shí)驗(yàn)對(duì)象組成：(1)空白對(duì)照組(A組)：接受開(kāi)腹及肝尾葉切除、關(guān)腹手術(shù),盲腸靜脈注射1mlPBS溶液；(2)傳統(tǒng)BMSCs治療組(B組)：接受開(kāi)腹及肝尾葉切除、關(guān)腹手術(shù),盲腸靜脈注射未經(jīng)病毒感染的傳統(tǒng)BMSCs細(xì)胞懸液1ml(1X107個(gè)細(xì)胞/m1)；(3)BMSCs-GFP示蹤治療組(空轉(zhuǎn)組)(C組)：接受開(kāi)腹及肝尾葉切除、關(guān)腹手術(shù),盲腸靜脈注射僅有GFP標(biāo)記,沒(méi)有RNA干擾序列的空白對(duì)照慢病毒感染的BMSCs-GFP細(xì)胞懸液1m1(1X107個(gè)細(xì)胞/m1)；(4)RNA干擾BMSCs治療組(D組)：接受開(kāi)腹及肝尾葉切除、關(guān)腹手術(shù),盲腸靜脈注射同時(shí)有GFP標(biāo)記及CTGF-RNA干擾序列的空白對(duì)照慢病毒感染的BMSCs-RNAi-GFP細(xì)胞懸液1ml(1X107個(gè)細(xì)胞/ml)。手術(shù)及干細(xì)胞移植一周后處死動(dòng)物,獲取肝臟及血清標(biāo)本,進(jìn)行以下檢測(cè)：(1)BMSCs移植樣本肝臟組織熒光鑒定； (2)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(Enzyme-linked Immuno Sorbent Assay,Elisa)法測(cè)定樣本血清中肝纖維化四項(xiàng)指標(biāo)：血清透明質(zhì)酸(Hyaluronic Acid, HA)、層粘連蛋白(Laminin, LN)、Ⅲ型前膠原氨端肽(Procollagen Ⅲ N-terminal Peptide, PⅢNP)、Ⅳ型膠原(Collagen Type Ⅳ,CⅣ)及結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(Conective Tissue Growth Factor, CTGF); (3)樣本肝臟組織病理切片HE染色； (4)免疫組織化學(xué)(Immunohistochemistry，，IHC)方法檢測(cè)樣本組織切片中CTGF蛋白表達(dá)的變化； (5)實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)肝臟標(biāo)本中CTGF基因mRNA表達(dá)水平； (6) Western blot方法檢測(cè)肝臟標(biāo)本中CTGF蛋白的表達(dá)水平。 結(jié)果： (1)轉(zhuǎn)染了用GFP標(biāo)記的BMSCs細(xì)胞后的熒光檢測(cè)照片顯示:BMSCs細(xì)胞經(jīng)門(mén)靜脈系注入肝纖維化模型后,能在大鼠肝臟中發(fā)現(xiàn)這些標(biāo)記了GFP的BMSCs。 (2)血清中肝纖維化四項(xiàng)指標(biāo)Elisa檢測(cè)顯示:BMSCs治療的3組中這4個(gè)指標(biāo)的表達(dá)量均顯著下降。而RNAi干擾CTGF的BMSCs治療的效果較BMSCs和GFP空轉(zhuǎn)的BMSCs治療效果要更好,血清四項(xiàng)的指標(biāo)要更接近于正常值。 (3)病理切片HE染色結(jié)果顯示：干擾CTGF(D組)后,]BMSCs治療效果更加顯著,小葉內(nèi)變性細(xì)胞數(shù)、壞死灶面積,匯管間擴(kuò)大程度及纖維索的數(shù)量均較模型組(A組)和傳統(tǒng)BMSCs組(B組)和空轉(zhuǎn)組(C組)有顯著改善,空轉(zhuǎn)組(C組)較模型組(A組)有很大改善,但是療效沒(méi)有CTGF干擾組(D組)顯著。 (4)IHC檢測(cè)CTGF蛋白表達(dá)顯示：BMSCs治療(B組、C組、D組)后表達(dá)CTGF的陽(yáng)性細(xì)胞較模型組(A組)明顯減少,其中傳統(tǒng)BMSCs組(B組)和空轉(zhuǎn)組(C組)改善的情況沒(méi)有CTGF干擾組(D組)顯著。D組中治療前后的陽(yáng)性表達(dá)區(qū)域(Average Optical Density, AOD)比值比較,治療前CTGF表達(dá)陽(yáng)性面積比為49.53±4.03,治療后陽(yáng)性面積為31.98±3.53,二者之間的P值為0.0083,達(dá)到了顯著性水平。 (5) Realtime PCR檢測(cè)顯示：使用了不同BMSCs治療的B組、C組和D組均可檢測(cè)到CTGF基因mRNA表達(dá)水平的降低,其中采用了RNA干擾的D組效果最為顯著。 (6) Western blot檢測(cè)顯示：隨肝纖維化程度的增加,CTGF蛋白表達(dá)量也隨之增加,而B(niǎo)MSCs治療之后CTGF的表達(dá)量較之模型組有顯著降低,RNAi干擾組的CTGF蛋白表達(dá)量為最低。 結(jié)論： (1)肝臟組織熒光鑒定結(jié)果提示：經(jīng)門(mén)靜脈途徑注射CTGF基因RNA干擾慢病毒感染BMSC后細(xì)胞可以定植在受損部位并可能生長(zhǎng)并修復(fù)受損的肝臟組織。 (2)結(jié)果部分(2)至(6)的檢測(cè)結(jié)果當(dāng)中:①CTGF基因在mRNA及蛋白表達(dá)水平都隨肝纖維化程度加重而上升的情況提示CTGF基因與肝纖維化病變進(jìn)展密切相關(guān)系,推測(cè)CTGF基因可能參與了肝纖維化病變進(jìn)展過(guò)程中某些關(guān)鍵的環(huán)節(jié)。②B組、C組、D組經(jīng)BMSCs治療后CTGF基因在轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)水平的明顯下降提示BMSCs可能影響CTGF基因在轉(zhuǎn)錄、蛋白表達(dá)水平等某些關(guān)鍵的環(huán)節(jié)；其中RNA干擾BMSCs治療后(D組)CTGF基因在轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)水平的下降及肝纖維化病變的減輕程度都較未經(jīng)RNA干擾BMSCs治療的B組、C組更為顯著。 (3)在B組、C組、D組經(jīng)BMSCs治療后并未發(fā)現(xiàn)BMSCs治療后加重肝纖維化的現(xiàn)象提示BMSCs加重肝纖維化可能只是特定條件下出現(xiàn)的偶然現(xiàn)象；但這并不能證明任何傳統(tǒng)或經(jīng)基因修飾的BMSCs移植對(duì)肝纖維化的治療是一定有效或毫無(wú)風(fēng)險(xiǎn)的,采用CTGF基因RNA干擾BMSCs移植的治療方法除了具有傳統(tǒng)BMSCs的相關(guān)治療作用外,還下調(diào)了BMSCs細(xì)胞內(nèi)CTGF基因在轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)水平的表達(dá),甚至改善了支配BMSCs分化方向的“小生境”從而可能在更大程度上在強(qiáng)化了BMSCs治療肝纖維化作用的同時(shí)還限制了BMSCs在某些特定條件下可能出現(xiàn)的由于CTGF基因表達(dá)水平上調(diào)或使得肝纖維化加重的風(fēng)險(xiǎn)。
【學(xué)位授予單位】：昆明醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類(lèi)號(hào)】：R575.2

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 王偉,張志堅(jiān),林建華3,吳秀麗,余良宏,康德智;大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增及表面標(biāo)志[J];福建醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2005年01期

2 毛婭妮;黃娟;肖偉;陳曉云;;針對(duì)小鼠VEGFA基因的siRNA干擾載體的構(gòu)建和慢病毒包裝[J];廣州醫(yī)藥;2011年05期

3 張瑞杰;苗向陽(yáng);;綿羊抑制素shRNA慢病毒干擾載體的構(gòu)建與鑒定[J];華北農(nóng)學(xué)報(bào);2011年03期

4 于春鵬;單鴻;姜在波;錢(qián)結(jié)勝;周斌;呂文天;王勁;龐鵬飛;;大鼠門(mén)靜脈系影像解剖學(xué)研究及穿刺入路的建立[J];當(dāng)代醫(yī)學(xué)(中國(guó)介入放射學(xué));2008年01期

5 常靜;雷寒;陳建斌;賈鋒鵬;;人間充質(zhì)干細(xì)胞免疫學(xué)性質(zhì)的對(duì)比研究[J];臨床心血管病雜志;2007年10期

6 白玉賢;劉磊;隋紅;魏孝禮;苑珩珩;;miRNA干擾Pokemon基因?qū)Υ竽c癌細(xì)胞增殖的影響及機(jī)制[J];臨床腫瘤學(xué)雜志;2011年11期

7 李慧;高春芳;;結(jié)締組織生長(zhǎng)因子在肝病中的研究進(jìn)展[J];現(xiàn)代免疫學(xué);2012年03期

8 葉平;蔣明德;;肝纖維化相關(guān)因素的研究現(xiàn)狀及進(jìn)展[J];新醫(yī)學(xué);2008年12期

9 王寶恩;慢性肝炎的診斷、分級(jí)與分期的新動(dòng)態(tài)[J];肝臟病雜志;1995年01期

10 陳江;陳玉滿(mǎn);夏勇;章榮華;蔡德雷;鄭云燕;嚴(yán)峻;;大鼠肝纖維化復(fù)合模型的建立及動(dòng)態(tài)觀(guān)察[J];中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志;2010年03期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前3條

1 張錦;肝腸鈣黏連蛋白（CDH17）在胃癌發(fā)生發(fā)展中作用的研究及其相關(guān)蛋白的篩選[D];武漢大學(xué);2011年

2 董瓊珠;骨橋蛋白不同剪切體及單體型在肝癌侵襲轉(zhuǎn)移中的功能與機(jī)制研究[D];復(fù)旦大學(xué);2009年

3 王岸聰;TLR4對(duì)卵巢癌細(xì)胞紫杉醇敏感性影響的實(shí)驗(yàn)研究[D];山東大學(xué);2009年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前9條

1 陳曉瑛;ω-3脂肪酸去飽和酶轉(zhuǎn)基因羊的研究[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2011年

2 盛鵬程;綿羊Myostatin基因shRNA慢病毒載體的構(gòu)建與鑒定[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2011年

3 劉志達(dá);實(shí)驗(yàn)性肝纖維化大鼠肝組織結(jié)締組織生長(zhǎng)因子動(dòng)態(tài)變化及其意義[D];河北醫(yī)科大學(xué);2006年

4 張偉;曲尼司特對(duì)實(shí)驗(yàn)性COPD大鼠氣道重塑的干預(yù)作用[D];東南大學(xué);2005年

5 焦?jié)?細(xì)胞因子在塵肺病中的表達(dá)及其意義[D];鄭州大學(xué);2007年

6 姜曉笛;RNA干擾抑制大鼠肝星狀細(xì)胞CTGF表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究[D];中國(guó)醫(yī)科大學(xué);2010年

7 薛美思;攜帶重組人胰島素基因的慢病毒載體轉(zhuǎn)染人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究[D];蘭州大學(xué);2010年

8 眭杰;siRNA雙靶向干擾IL-1β/TNF-α治療肩袖疾病患者肩峰下滑囊炎的實(shí)驗(yàn)研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2012年

9 區(qū)永聰;miRNA沉默ATM基因?qū)epG2在電離輻射后DNA的損傷及修復(fù)的影響[D];南方醫(yī)科大學(xué);2011年

本文編號(hào)：2661453