【摘要】： 肝纖維化是各種不同致病因子引起慢性肝病進而發(fā)展為肝硬化的共有病理改變,是肝臟對各種慢性損傷產(chǎn)生的一種修復反應,其共同特點是以膠原為主的細胞外間質(extracellular matrix, ECM)的過度沉積�；罨母涡菭罴毎�(hepatic stellate cells, HSC)是肝臟產(chǎn)生過度膠原的主要細胞。在各種促纖維生成因素的作用下,HSC從靜止狀態(tài)轉變?yōu)榛罨癄顟B(tài)即產(chǎn)生膠原的肌成纖維樣細胞。 交感神經(jīng)系統(tǒng)(sympathetic nervous system, SNS)是肝內神經(jīng)的重要組成部分,參與肝臟功能、新陳代謝等方面的調控。近年來越來越多的研究顯示,交感神經(jīng)系統(tǒng)可通過對HSC增殖和凋亡等細胞行為的調控,影響肝纖維化的發(fā)生發(fā)展�？ňS地洛是一種具有多種作用的交感神經(jīng)腎上腺素能受體阻滯劑包括非選擇性的β阻滯和α1阻滯,并且是一種強的抗氧化物和強的反應性的氧自由基清除劑。研究發(fā)現(xiàn)卡維地洛可通過其交感神經(jīng)受體阻滯作用直接抑制心臟成纖維細胞的增殖,進而阻止細胞外間質的合成,以達到減輕心臟間質重塑,預防心力衰竭發(fā)生發(fā)展的作用。然而,其在肝纖維化中的作用,尤其是對肝纖維化過程中的膠原代謝及氧化應激的影響,目前國內外少有報道。我們前期的研究已顯示卡維地洛可以抑制肝纖維化大鼠肝組織的HSC活化增殖,促進活化HSC凋亡。本研究將進一步研究該藥對肝纖維化病理過程中肝組織Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型膠原代謝的調控作用及氧化應激的影響。 目的:觀察腎上腺素能受體阻滯劑卡維地洛對膽汁淤積性大鼠纖維化肝組織中Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型膠原代謝及氧化應激的影響。 方法:采用膽總管結扎法建立膽汁淤積性大鼠肝纖維化模型,并給予卡維地洛進行藥物干預,將50只雄性Sprague Dawley大鼠隨機分成假手術對照組、模型組、小劑量卡維地洛組(0.1 mg·kg~(-1)·d~(-1))、中等劑量卡維地洛組(1 mg·kg~(-1)·d~(-1))和大劑量卡維地洛組(10mg·kg~(-1)·d~(-1)),共5組,每組10只。各組又隨機分成兩小組,分別在術后2 wk、4 wk留取肝組織。應用HE、Masson染色了解肝臟病理組織學變化及纖維化程度;分別應用黃嘌呤氧化酶法和硫代巴比妥酸法(TBA)檢測肝組織SOD活性和MDA水平,以了解肝組織氧化應激狀態(tài);應用免疫組織化學法對肝組織Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型膠原及TGF-β1含量及分布進行檢測;應用Western Blot及Real time Q-PCR檢測肝組織MMP-2及TIMP-2在肝纖維化過程中的動態(tài)表達。 結果: 1術后大鼠一般情況觀察 大鼠膽總管結扎后1 h～2 h恢復活動,48 h左右尿液變黃,3～4天后皮膚毛發(fā)開始轉黃,精神逐漸變差,進食量少于對照組,體重增加不明顯或稍有下降。8～9天后逐漸出現(xiàn)嗜睡,反應遲鈍,活動減少,黃疸明顯,鼠糞呈灰白色。20天后進食量明顯減少,體重與對照組相比明顯降低,并且部分大鼠逐漸出現(xiàn)腹部隆起。 2膽汁淤積性大鼠肝纖維化模型成功建立 模型大鼠肝臟肉眼觀呈褐綠色或棕色,表面略呈細顆粒狀,質地變硬,造模4 wk組共3只大鼠有腹水產(chǎn)生。HE及Masson三色染色顯示,假手術對照組肝小葉結構完整,肝板排列整齊,肝細胞無腫脹,無膽管增生,無淤膽及淋巴細胞浸潤,核仁清晰,少量結締組織局限于門管區(qū)。造模2 wk,模型組肝板正常排列消失,小葉結構紊亂,門管區(qū)小膽管廣泛增生,并向小葉內延伸、肝小葉呈花環(huán)狀;新生小膽管周圍纖維組織增生,門管區(qū)面積擴大,肝小葉內亦有纖維組織增生。造模4 wk,模型組肝臟廣泛纖維結締組織增生,增生的纖維間隔互相連接、包繞、分割,改建原來的肝小葉甚至形成假小葉。 3卡維地洛對肝臟病理組織學的影響 HE染色顯示,造模2 wk,卡維地洛各劑量組較模型組纖維組織及小膽管增生減少,肝索迂曲及肝小葉結構破壞較輕;造模4 wk,卡維地洛各劑量組仍有肝小葉正常結構部分破壞,但小葉周邊及匯管區(qū)纖維組織增生較輕,肝索紊亂較模型組輕,并可見肝細胞再生現(xiàn)象。 Masson三色染色顯示,造模2 wk,模型組和小、中、大劑量給藥組膠原面積密度均顯著高于假手術對照組,P0.01;小劑量給藥組與模型組相比無明顯差異,P0.05;中、大劑量給藥組與模型組相比有明顯降低,P0.05、P0.01;中、大劑量給藥組與小劑量組相比也有明顯降低,P0.05、P0.01;中、大劑量給藥組之間無明顯差異,P0.05。造模4 wk,模型組和小、中、大劑量給藥組膠原面積密度均顯著高于假手術對照組,P0.01;小、中、大劑量給藥組均與模型組相比也均有明顯降低,P0.05、P0.01、P0.01;大劑量給藥組明顯低于小、中劑量組,P0.01、P0.05;而小、中劑量給藥組之間無明顯差異,P0.05。 4卡維地洛下調大鼠纖維化肝組織的膠原表達 4.1卡維地洛降低2周Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ型膠原的表達 免疫組織化學染色顯示,造模2 wk,模型組和小、中、大劑量給藥組肝組織Ⅰ型膠原陽性面積密度(15.99%±1.47%, 12.66%±1.89%,11.24%±0.60%,10.58%±3.74%)均顯著高于假手術對照組(3.05%±1.02%),P0.01;小、中、大劑量給藥組與模型組相比明顯降低,P0.05,P0.05,P0.01;各給藥組之間差異無顯著性,P0.05。模型組和小、中、大劑量給藥組肝組織Ⅲ型膠原陽性面積密度(17.85%±1.92%,14.14%±0.64%,11.96%±2.01%,10.27%±0.99%)與假手術對照組(5.18%±0.79%)相比均顯著增高,P0.01;而小、中、大劑量給藥組與模型組相比顯著降低,P0.01;大劑量給藥組明顯低于小劑量給藥組,P0.01,但小劑量組與中劑量組,中劑量組與大劑量組之間無顯著差異,P0.05。模型組和小、中、大劑量給藥組肝組織Ⅳ型膠原陽性面積密度(11.89%±1.45%,9.30%±1.01%,9.14%±1.48%,8.80%±1.21%)比假手術對照組(1.82%±0.77%)顯著增高,P0.01;且小、中、大劑量給藥組較模型組均明顯降低,P0.05;而小、中、大劑量給藥組之間差異無顯著性,P0.05。 4.2卡維地洛降低4周Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ型膠原的表達免疫組織化學染色顯示,造模4 wk,模型組和小、中、 大劑量給藥組肝組織Ⅰ型膠原陽性面積密度(23.69%±2.95%,15.74%±0.51%,14.57%±1.55%,12.54%±3.64%)均顯著高于假手術對照組(4.14%±0.98%),P0.01;小、中、大劑量給藥組與模型組相比明顯降低,P0.01;而小、中、大劑量給藥組之間差異無顯著性,P0.05。模型組和小、中、大劑量給藥組肝組織Ⅲ型膠原陽性面積密度(21.53%±0.76% ,16.84%±1.99%,16.03%±0.42%,11.17%±2.30%)較假手術對照組(5.48%±0.79%)均顯著增高,P0.01;小、中、大劑量給藥組均低于模型組,P0.01;且大劑量給藥組顯著低于小、中劑量給藥組,P0.01;但小與中劑量給藥組之間無明顯差異,P0.05。模型組和小、中、大劑量給藥組肝組織Ⅳ型膠原陽性面積密度(18.05%±1.15% , 12.02%±1.50% ,11.41%±1.65%,9.84%±2.08%)比假手術對照組(2.01%±0.49%)均顯著增高,P0.01;而小、中、大劑量給藥組與模型組相比明顯降低,P0.01;小、中、大劑量給藥組之間差異無顯著性,P0.05。 5卡維地洛對肝組織MMP-2蛋白及mRNA表達的影響 Western Blot分析顯示,造模2 wk,模型組和小、中劑量給藥組肝組織MMP-2蛋白相對表達量(1.99±0.13,1.87±0.12,1.88±0.04)顯著高于假手術對照組(1.24±0.09),P0. 01;而大劑量給藥組(1.33±0.04)與假手術對照組之間無明顯差異,P0.05;大劑量給藥組明顯低于模型組、小、中劑量給藥組, P 0.01,而小、中劑量給藥組及模型組之間相比無明顯差異,P0.05。造模4 wk,模型組MMP-2蛋白相對表達量(1.49±0.22)明顯較2周時降低;小、中、大劑量給藥組MMP-2蛋白相對表達量(1.74±0.17,1.99±0.16,2.15±0.24)均高于假手術組(1.26±0.13),P0.01;中、大劑量給藥組與模型組相比均明顯升高,P0.01;大劑量給藥組明顯高于小劑量給藥組,P0.01;而模型組與假手術對照組、小劑量給藥組與模型組、小劑量給藥組與中劑量給藥組以及中劑量給藥組與大劑量給藥組之間無顯著性差異,P0.05。 應用Real time Q-PCR檢測大鼠肝組織MMP-2 mRNA表達。結果顯示,造模2 wk,以假手術對照組表達量為1,則模型組及小、中、大劑量給藥組肝組織MMP-2 mRNA相對假手術對照組的表達量為1.83,1.58,1.53及1.12;模型組及小、中劑量給藥組顯著高于假手術對照組,P0.01;大劑量給藥組較模型組及小、中劑量給藥組明顯降低,P0.05,而小劑量給藥組與中劑量給藥組,大劑量給藥組與假手術對照組之間相比無明顯差異,P0.05。造模4 wk,以假手術對照組表達量為1,模型組MMP-2 mRNA相對表達量1.28明顯較2周時降低;小、中、大劑量給藥組MMP-2 mRNA相對假手術對照組的表達量為1.66、1.92、1.98均高于假手術組,P0.01;中、大劑量給藥組與模型組相比均明顯升高,P0.01;而模型組與假手術對照組,小劑量給藥組及中劑量給藥組與模型組,小劑量給藥組與中劑量給藥組以及中劑量給藥組與大劑量給藥組之間無顯著性差異,P0.05。 6卡維地洛下調大鼠纖維化肝組織TIMP-2蛋白及mRNA表達 Western Blot分析顯示,造模2 wk,模型組和小、中、大劑量給藥組肝組織TIMP-2蛋白相對表達量(1.41±0.09,1.32±0.05,1.27±0.23,0.78±0.06)均顯著高于假手術對照組(0.53±0.05),P0.01,P0.01,P0.01,P0.05;大劑量給藥組較模型組明顯降低,P0.01。大劑量給藥組也明顯低于小、中劑量給藥組,P 0.01;而小、中劑量給藥組與模型組,小、中劑量給藥組之間相比無明顯差異,P0.05。造模4 wk,模型組和小、中、大劑量給藥組肝組織TIMP-2蛋白相對表達量(1.42±0.07,1.12±0.13,1.06±0.15,0.92±0.07)顯著高于假手術對照組(0.56±0.09),P0.01;小、中、大劑量給藥組與模型組相比明顯降低,P0.01;大劑量給藥組明顯低于小劑量給藥組,P 0.05;而小、中劑量給藥組之間以及中、大劑量給藥組之間相比無明顯差異,P0.05。 應用Real time Q-PCR檢測大鼠肝組織TIMP-2mRNA表達。結果顯示,造模2 wk,以假手術對照組表達量為1,則模型組及小、中、大劑量給藥組肝組織TIMP-2 mRNA相對假手術對照組的表達量為2.73,2.56,2.38及1.70;模型組及小、中、大劑量給藥組顯著高于假手術對照組,P0.01,P0.01,P0.01,P0.05;大劑量給藥組較模型組及小、中劑量給藥組明顯降低,P0.01,P0.05,P0.05;而小、中劑量給藥組與模型組之間比較無明顯差異,P0.05。造模4 wk,以假手術對照組表達量為1,則模型組及小、中、大劑量給藥組肝組織TIMP-2 mRNA相對假手術對照組的表達量為2.67,1.97,1.89及1.54;模型組及小、中、大劑量給藥組顯著高于假手術對照組,P0.01,P0.01,P0.01,P0.05;小、中、大劑量給藥組較模型組均明顯降低,P0.05,P0.01,P0.01;而小、中、大劑量給藥組之間無明顯差異,P0.05。 7卡維地洛降低肝組織中TGF-β1表達 免疫組織化學結果顯示:造模2 wk,模型組和小、中、大劑量給藥組肝組織TGF-β1陽性面積密度(10.10%±1.14%,9.51%±1.07%,7.14%±1.60%,6.44%±3.64%)均顯著高于假手術對照組(4.14%±0.82%),P0.01;中、大劑量給藥組與模型組相比明顯降低,P0.01;且中、大劑量給藥組明顯低于小劑量給藥組,P0.05;而小劑量給藥組與模型組,以及中劑量與大劑量給藥組之間差異無顯著性,P0.05。造模4 wk,模型組和小、中、大劑量給藥組肝組織TGF-β1陽性面積密度(14.00%±1.81%,7.35%±0.68%,7.04%±0.33%,6.53%±0.81%)較假手術對照組(4.64%±0.34%)均顯著增高,P0.01, P0.01, P0.05, P0.05;而小、中、大劑量給藥組與模型組相比亦顯著降低,P0.01;但小、中、大劑量給藥組之間差異無顯著性,P0.05。 8卡維地洛對大鼠纖維化肝組織氧化應激的影響 8.1卡維地洛降低大鼠纖維化肝組織中MDA(nmol/mg)含量 硫代巴比妥酸法檢測顯示,造模2 wk,模型組和小、中、大劑量給藥組大鼠肝組織MDA含量(0.94±0.19,0.73±0.09,0.67±0.62,0.63±0.09)均顯著高于假手術對照組(0.41±0.06),P0.01;小、中、大劑量給藥組MDA含量較模型組均明顯降低,P0.01;而小、中、大劑量給藥組之間相比無顯著性差異,P0.05。造模4 wk,模型組和小、中、大劑量給藥組MDA含量(1.21±0.23,0.98±0.13,1.00±0.03,1.10±0.14)均高于假手術組(0.43±0.07),P0.01;小、中、大劑量給藥組及模型組之間比較差異無顯著性,P0.05。 8.2卡維地洛增加大鼠纖維化肝組織中SOD(U/mgprot)活性 黃嘌呤氧化酶法檢測顯示,造模2 wk,模型組和小、中、大劑量給藥組大鼠肝組織SOD的值(1.48±0.14,1.73±0.13,1.78±0.11,1.84±0.16)均顯著低于假手術對照組(2.24±0.11),P0.01。小、中、大劑量給藥組與模型組相比顯著增高,P0.01;小、中、大劑量給藥組之間無明顯差異,P0.05。造模4 wk,模型組和小、中、大劑量給藥組大鼠肝組織SOD的值(0.84±0.06,1.50±0.10,1.66±0.14,1.67±0.19)均顯著低于假手術對照組(2.32±0.14),P0.01。小、中、大劑量給藥組與模型組相比顯著增高,P0.01;而小、中、大劑量給藥組之間無顯著性差異,P0.05。 結論: 1卡維地洛可以下調纖維化肝組織中的Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型膠原蛋白表達,這種作用尤以大劑量組最為顯著。 2卡維地洛在基因及蛋白水平下調肝纖維化早期MMP-2表達,上調肝纖維化晚期MMP-2表達,并持續(xù)下調TIMP-2 mRNA及蛋白表達,促進MMP-2/TIMP-2平衡的恢復;下調大鼠纖維化肝組織中TGF-β1的表達。這可能是卡維地洛下調肝纖維化組織中Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型膠原表達,減緩肝纖維化進程的機制之一。 3卡維地洛可通過降低大鼠纖維化肝組織中MDA的含量、增高SOD的活性,從而起到拮抗肝纖維化過程中氧化應激損傷的作用。
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R575.2

【參考文獻】

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本文編號：2661269