發(fā)布時間：2020-05-12 12:04

【摘要】： 目的：肝星狀細(xì)胞(HSC)激活增殖并轉(zhuǎn)分化為成纖維母細(xì)胞是導(dǎo)致肝纖維化的主要病理機制之一。多條細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與了HSC的激活增殖與轉(zhuǎn)分化過程的調(diào)控。乙醛是激活HSC并導(dǎo)致酒精性肝纖維化發(fā)生的關(guān)鍵分子。本實驗以大鼠肝星狀細(xì)胞株(HSC-T6)為研究對象,采用乙醛激活HSC-T6增殖并轉(zhuǎn)分化,并分別使用特異性阻斷劑SB-431542和DAPT阻斷TGF-β/ALK5和Notch兩條信號通路,觀察TGF-β/ALK5和Notch信號通路在肝星狀細(xì)胞活化中的作用,進而探討兩條信號通路之間的“串話”及其對肝星狀細(xì)胞活化的調(diào)控,為闡明Notch信號通路在肝纖維化中的作用及其分子機制提供實驗依據(jù)。方法：①HSC的培養(yǎng)及處理：HSC分為對照組和乙醛刺激組,每組又隨機分為4組。對照組包括空白組、TGF-β阻斷組(SB-431542 10μmol/L)、Notch阻斷組(DAPT 200nmol/L)和TGF+Notch阻斷組(SB-431542 10μmol/L+DAPT 200nmol/L)。實驗組包括單純乙醛刺激組、TGF-β阻斷+乙醛刺激組、Notch阻斷+乙醛刺激組和TGF阻斷+Notch阻斷+乙醛刺激組。各組細(xì)胞培養(yǎng)至融合度70%-80%時,0.4%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基同步化處理細(xì)胞12h后,更換為完全培養(yǎng)基。對照組用對應(yīng)的抑制劑處理培養(yǎng),刺激組在對應(yīng)的抑制劑預(yù)處理1h后給予乙醛刺激(200μmol/L)刺激,每12h補加一次,刺激24h。24h后收集各組細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)基上清液并行細(xì)胞爬片。②RT-PCR:利用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA,紫外分光光度法檢測總RNA濃度及純度,根據(jù)操作流程用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA,瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物,Quantity One軟件分析結(jié)果。③Western blot:裂解細(xì)胞并提取總蛋白,考馬斯亮藍(lán)G-250法蛋白定量。SDS-PAGE后半干式電轉(zhuǎn)移至PVDF膜。電轉(zhuǎn)移結(jié)束后PVDF膜用洗膜緩沖液TBST洗滌3×5min,封阻緩沖液(5%BSA)在室溫下密閉輕搖動封阻1h。洗滌3×5min,PVDF膜與Ⅰ抗稀釋液室溫下輕搖動孵育2h,洗滌3×5min。PVDF膜與Ⅱ抗稀釋液于室溫下輕搖動孵育1h,洗滌3×5min。加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑A、B液各0.5ml,混勻,潤透PVDF膜后室溫作用1min。暗室中將PVDF膜迅速封入保鮮膜中,Kodak X-ray film壓片,放射自顯影5min。X-ray film置于顯影液中15-30sec,定影液中1.5min,清水沖洗晾干。Quantity One軟件分析結(jié)果。④檢測指標(biāo)：VG染色檢測HSC增殖的形態(tài)學(xué)改變；MTT法檢測細(xì)胞增殖；ELISA法檢測TIMPⅠ和FN；RT-PCR方法檢測HSC中RBP-JK、Hes1和Smad3的mRNA水平；Western blot檢測HSC-T6中RBP-JK、Hes1、Smad3和a-SMA.的蛋白水平。結(jié)果：①HSC活性和增殖的變化：VG染色發(fā)現(xiàn)乙醛刺激明顯促進HSC貼壁及重疊、明顯促進HSC增殖和顯著增加膠原纖維蛋白的表達(dá)。MTT檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙醛刺激明顯增強HSC活性(P0.05),培養(yǎng)至72h時,細(xì)胞活性達(dá)最高峰。表明乙醛刺激作用可增強HSC活性。特異性阻斷劑SB-431542或DAPT預(yù)處理阻斷乙醛刺激對HSC活性的上調(diào)(P0.05),SB-431542和DAPT協(xié)同作用也有效阻斷乙醛刺激對HSC活性的上調(diào)(P0.05)。②TIMPI和FN表達(dá)變化：ELISA結(jié)果表明乙醛刺激組較對照組TIMP I和FN的表達(dá)明顯上調(diào)(P0.05),說明乙醛刺激明顯增強HSC中TIMPI和FN表達(dá)。特異性阻斷劑SB-431542或DAPT預(yù)處理幾乎阻斷乙醛刺激對TIMP I和FN的上調(diào)作用(P0.05),但是未發(fā)現(xiàn)兩種阻斷劑存在協(xié)同作用。③RBP-JK、Hes1和Smad3表達(dá)及活性的變化：RT-PCR和Western blotting檢測結(jié)果顯示,乙醛刺激對RBP-JK的表達(dá)無顯著性上調(diào)(P0.05),表明乙醛刺激對Notch通路節(jié)點分子RBP-JK無明顯上調(diào)作用；TGF-β和Notch通路阻斷均導(dǎo)致RBP-JK下調(diào)(P0.05),二者同時阻斷對RBP-JK的下調(diào)作用明顯強于TGF-B和Notch通路單獨阻斷(P0.05),表明TGF-β通路對Notch通路節(jié)點分子RBP-JK有調(diào)控作用。在同時阻斷兩條通路時可能出現(xiàn)協(xié)同作用,又RBP-JK是Notch通路的上游靶點,說明TGF-B通路與Notch通路的胞內(nèi)段NICD的直接作用,實現(xiàn)兩個信號通路之間的相互“對話”。RT-PCR和Western blotting檢測結(jié)果顯示,乙醛刺激顯著上調(diào)Hes1表達(dá)(P0.05),TGF-β和Notch通路阻斷對乙醛刺激引起的Hes1上調(diào)均有明顯的抑制作用(P0.05),且二者協(xié)同阻斷的抑制作用更為明顯(P0.05)。上述表明乙醛刺激對Notch通路中Hes1有明顯上調(diào)作用,且TGF-B通路對Notch通路節(jié)點分子基因Hesl具有調(diào)節(jié)作用,TGF-B通路和Notch通路在Hes1的調(diào)節(jié)中具有協(xié)同作用。RT-PCR和Western blotting檢測結(jié)果顯示,乙醛刺激空白組較對照空白組Smad3的mRNA水平有明顯上調(diào)(P0.05),表明乙醛刺激對Smad3轉(zhuǎn)錄水平有顯著性上調(diào)。TGF-β和Notch通路阻斷明顯下調(diào)乙醛刺激對Smad3轉(zhuǎn)錄水平的上調(diào)(P0.05),表明乙醛刺激后,TGF-β通路與Notch通路對Smad3轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)具有協(xié)同作用。但總Smad3蛋白條帶無明顯差異性改變(P0.05),具體原因有待后續(xù)實驗闡明。Western blotting檢測結(jié)果顯示,乙醛刺激顯著促進p-Smad3-S425水平(P0.05),Notch單阻斷組或TGF-β和Notch雙阻斷組都明顯抑制乙醛刺激導(dǎo)致的p-Smad3-S425上調(diào)(P0.05),且雙阻斷較單阻斷的抑制作用明顯(P0.05),顯示TGF-β阻斷對Notch阻斷具有協(xié)同作用。④a-SMA表達(dá)的變化：Western blotting檢測結(jié)果顯示,乙醛刺激明顯促進a-SMA表達(dá)(P0.05),表明乙醛刺激能上調(diào)TGF-β通路的活化導(dǎo)致效應(yīng)蛋白a-SMA表達(dá)；TGF-B和Notch通路阻斷明顯抑制乙醛刺激對a-SMA的上調(diào)(P0.05)。在乙醛刺激刺激時,雙阻斷組較TGF-β阻斷組對a-SMA表達(dá)上調(diào)的抑制作用明顯(P0.05),表明顯示二者阻斷劑具有協(xié)同作用。結(jié)論：①乙醛刺激可明顯激活HSC,促進HSC增殖及轉(zhuǎn)分化；②SB-431542和DAPT均可明顯拮抗HSC活化增殖與轉(zhuǎn)分化,即拮抗HSC的纖維化；③Notch信號通路對乙醛刺激HSC活化具有明顯調(diào)節(jié)作用；乙醛刺激后TGF-B通路對Notch通路節(jié)點分子RBP-JK、Hesl有明顯調(diào)控;TGF-β與Notch信號通路間存在"cross-talk",CSL(RBP-JK)可能是兩條途徑串話的“交叉點”,而Hesl是信號途徑的直接靶點
【圖文】：

圖1培養(yǎng)72h的大鼠(Rat)肝星狀細(xì)胞A對照組培養(yǎng)72h的大鼠(Rat)肝星狀細(xì)胞(xloo);B.對照組培養(yǎng)72h的大鼠(Rat)肝星狀細(xì)胞(x200);C.乙醛刺激組培養(yǎng)72h的大鼠(Rat)肝星狀細(xì)胞(x100);D.乙醛刺激組培養(yǎng)72h的大鼠(Rat)肝星狀細(xì)胞(x200)Fig.1HePatiestellateeells峨er72hourscuituringA.HePatiestellatecellsineontrolgrouPafter72如ursculturing(x100);B.HePatiestellateeellsincontrolgrouPafter72hoursculturi五g(x200)C.HePatiestellatecellsinaeetaldehydest加ulationgrouPafter72hoursculturing(x100)D.H叩atiestellateeellsinacetaldehydestlinulationgrouPa丘er72hourscultu血g(x200)大鼠(Rat)肝星狀細(xì)胞(HSC)經(jīng)72h培養(yǎng)后，生長達(dá)到>98%豐度。經(jīng)含鐵的蘇木素染色，細(xì)胞內(nèi)質(zhì)呈淡藍(lán)黑色，外質(zhì)收縮，剩下部分不著色或色澤更淺。圓形細(xì)胞核呈藍(lán)黑色。居中的核仁呈黑色小圓點。細(xì)胞生長旺盛，胞體豐滿，折光性強，表現(xiàn)出良好的生長狀態(tài)。

2.2ELISA法檢測1型膠原蛋白(TIMPI)、纖維粘連素(FN)大鼠(Rat)肝星狀細(xì)胞培養(yǎng)36h后，按組加入TGF一B阻斷劑SB一431542(終濃度1咖mol/L)、Notch阻斷劑DAPT(終濃度Zoonmol/L)預(yù)處理1h，對照組繼續(xù)培養(yǎng)24h;乙醛刺激組預(yù)處理lh，，在加入乙醛刺激劑(終濃度20伽mol幾)培養(yǎng)24h后。酶標(biāo)儀檢測各組OD值，利用回歸計算公式計算各組含量得EUSA測定結(jié)果。顯示:加入阻斷劑后I型膠原蛋白(TIMPI);纖維粘連素(FN)明顯下調(diào)，單阻斷組間含量基本一致，但雙阻斷組與單阻斷組比較可見明顯下調(diào)。結(jié)果見表5、圖6A(TIMPI)及圖6B(FN)。
【學(xué)位授予單位】：瀘州醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R575.2

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本文編號：2660193