發(fā)布時間：2020-05-10 15:11

【摘要】：目的探討TGF-β1對大鼠肝細胞系BRL-3A增殖的影響,并進一步通過靶向大鼠Smad3基因shRNA慢病毒沉默TGF-β1下游的SMAD3蛋白,再次觀察BRL-3A增殖的變化,初步研究TGF-β1對BRL-3A增殖影響的作用機制,為以后設計基于TGF-β1通路、以促進肝再生為治療目的的相應研究奠定基礎(chǔ)。 方法(1)MTT法檢測TGF-β1對細胞增殖的影響：將BRL-3A細胞分為6組,分別給予不同濃度的TGF-β1(0、2、4、6、8、10ng/ml),檢測各組細胞24h、36h、48h時的增殖活性；(2)進一步將BRL-3A細胞分為TGF-β1處理組和對照組,分別給予和不予TGF-β1 (8ng/ml),進行如下檢測：①流式細胞儀檢測兩組細胞24h、36h、48h時的凋亡情況和細胞周期分布；②實時定量RT-PCR檢測兩組細胞24h、36h、48h時CyclinE、Cdk-2、EGF、HGF、Bcl-2、C-myc、MMP9、NF-κB基因的表達變化；(3)包裝并滴定靶向大鼠Smad3基因shRNA慢病毒,以MOI=5感染BRL-3A,用實時定量RT-PCR和Western-blot分別檢測Smad3 mRNA和SMAD3蛋白的表達,以鑒定該慢病毒沉默BRL-3A中SMAD3表達的功能；(4)以正常BRL-3A和靶向Smad3基因shRNA慢病毒感染后的BRL-3A各為1組,用MTT法檢測兩組細胞的增殖活性,流式細胞儀檢測兩組細胞的細胞周期分布,實時定量RT-PCR檢測兩組細胞CyclinE、Cdk-2、EGF、HGF、Bcl-2、C-myc、MMP9、NF-κB基因的表達變化。 結(jié)果(1)MTT結(jié)果顯示,各濃度TGF-β1組在24h、36h、48h時的細胞增殖活性差異均無統(tǒng)計學意義；(2)流式細胞儀分析結(jié)果顯示,TGF-β1處理組24h、36h、48h時的細胞凋亡率較對照組有所上升,但統(tǒng)計學未顯示明顯差別；同時,細胞周期分布與對照組間的差異也無統(tǒng)計學意義；(3)實時定量RT-PCR發(fā)現(xiàn),TGF-β1處理組相對于對照組,CyclinE mRNA、Cdk2 mRNA、EGF mRNA在24h時分別下調(diào)至0.194±0.103、0.181+0.064、0.634±0.116倍,36h時分別下調(diào)至0.379+0.173、0.457±0.123、0.619±0.112倍,48h時分別上調(diào)至1.956+0.215、2.17+0.471、7.66+0.437倍；HGF mRNA在24h、36h、48h時均明顯下調(diào),分別至0.152±0.068、0.146+0.053、0.158±0.061倍；Bcl-2 mRNA在24h、36h時無統(tǒng)計學差異,48h時上調(diào)至1.567±0.115倍；C-myc mRNA、MMP9 mRNA、NF-κB mRNA在3個時刻均上調(diào),24h時分別至1.742±0.389、3.484±0.411、1.625±0.369倍,36h時分別至2.292±0.361、1.563±0.323、1.486±0.494倍,48h時分別至2.499±0.475、2.233±0.493、3.612±0.364倍。以上基因表達差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05)；(4)包裝并滴定靶向Smad3基因shRNA慢病毒獲得了具有感染活性的慢病毒顆粒,滴度為2.75×107Tu/ml,以MOI=5感染BRL-3A的感染率為98.59%。實時定量RT-PCR發(fā)現(xiàn),病毒組相對于正常組Smad3mRNA下調(diào)至0.340±0.153倍(t=17.169,P=0.000), Western-blot顯示病毒組SMAD3表達較正常組明顯減低,差異有統(tǒng)計學意義(t=7.042,P=0.002)；(5)MTT和流式細胞儀分析發(fā)現(xiàn)正常組和病毒組間的吸光值及細胞周期分布差異均無統(tǒng)計學意義。實時定量RT-PCR發(fā)現(xiàn),病毒組相對于正常組CyclinEmRNA、Cdk-2mRNA、MMP9mRNA分別下調(diào)至0.093±0.032、0.083±0.02、0.039+0.005倍,P值分別為0.030、0.002、0.001,而EGFmRNA、HGFmRNA、Bcl-2mRNA、C-mycmRNA、NF-κBmRNA表達變化均無統(tǒng)計學意義。結(jié)論大鼠肝細胞系BRL-3A對TGF-β1促凋亡和細胞周期阻滯作用的敏感性低下,可能與非Smads途徑的激活,NF-κB、Bcl-2、C-myc、MMP9表達的上調(diào)有關(guān)。阻斷TGF-β1/Smads通路下游的SMAD3蛋白后BRL-3A并未表現(xiàn)出增殖活性的改變,NF-κB、Bcl-2、C-myc表達也未發(fā)生有統(tǒng)計學意義的改變,進一步說明非Smads途徑可能是TGF-β1影響B(tài)RL-3A增殖的重要途徑。
【學位授予單位】：山西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R575

【參考文獻】

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1 陳源文;徐雷鳴;董國芳;吳建新;汪余勤;李定國;;粉防己堿對大鼠靜止期肝星狀細胞細胞周期的影響[J];胃腸病學和肝病學雜志;2009年09期

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本文編號：2657494