【摘要】： 研究背景：急性肝衰竭(acute liver failure, ALF)是一種嚴(yán)重危害人類生命健康的臨床綜合征,肝移植是目前最有效的治療肝衰竭的方法,但是,肝移植由于供體短缺及費(fèi)用昂貴等問題限制了其廣泛應(yīng)用。因此,迫切需要探索新的治療方法以挽救肝衰竭患者的生命。近年來許多動物及臨床研究發(fā)現(xiàn),骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cell, BMSC)可以在體內(nèi)外誘導(dǎo)分化為肝細(xì)胞,BMSC移植可以在體內(nèi)增殖、分化為肝細(xì)胞或肝樣細(xì)胞,替代受損的肝細(xì)胞,促進(jìn)肝功能恢復(fù),因此,有人已將BMSC移植用于治療ALF并顯示出具有顯著的療效。目前,對于BMSC治療肝衰竭作用機(jī)制的研究主要集中在BMSC的分化潛能方面。然而實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),BMSC在體外誘導(dǎo)分化為肝細(xì)胞需要6-12天,體內(nèi)分化也需要4-5天,而BMSC在移植的早期未分化為肝細(xì)胞或肝樣細(xì)胞時(shí)即顯示出具有顯著的療效,用干細(xì)胞分化機(jī)制不足以解釋BMSC移植的這種早期應(yīng)答。那么,BMSC移植早期是通過何種機(jī)制發(fā)揮作用?有研究提出,BMSC具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用,這種作用是否在BMSC移植早期發(fā)揮其效應(yīng)?另外,大量臨床研究結(jié)果表明,ALF患者伴有的腸源性內(nèi)毒素血癥(Intestinal Endotoxemia, IETM)在肝衰竭的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用,內(nèi)毒素可以直接損傷肝細(xì)胞,還可以激活下游炎癥級聯(lián)反應(yīng),引起大量肝細(xì)胞凋亡及壞死,導(dǎo)致肝衰竭。韓德五教授提出了IETM是各種原因?qū)е赂嗡ソ甙l(fā)生的唯一的共同物質(zhì)基礎(chǔ),并且這一理論在實(shí)驗(yàn)和臨床研究中已經(jīng)得以證實(shí)。那么：BMSC對ALF大鼠IETM究竟有何作用?其作用機(jī)制如何?是本文的研究重點(diǎn)。 本課題首先建立一種簡便、快捷的體外分離培養(yǎng)大鼠BMSC的方法,在此基礎(chǔ)上觀察BMSC移植治療ALF大鼠的作用,從細(xì)胞水平及在體水平探討其可能的機(jī)制,為臨床治療ALF提供新的思路。 本研究共分三個(gè)部分： 第一部分骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及其生物學(xué)特性的研究 第二部分骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對急性肝衰竭大鼠腸源性內(nèi)毒素血癥的影響 第三部分骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對急性肝衰竭大鼠腸源性內(nèi)毒素血癥治療作用機(jī)制的研究 第一部分骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及其生物學(xué)特性的研究 目的建立一種簡便、快速、有效的體外分離培養(yǎng)大鼠BMSC的方法并進(jìn)行初步鑒定。 方法無菌條件下取大鼠四肢長骨骨髓,在含20%胎牛血清的DMEM/F12中貼壁培養(yǎng),倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)變化；采用免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測細(xì)胞膜抗原CD34、CD44及CD45的表達(dá)；采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期；細(xì)胞加成脂誘導(dǎo)劑體外培養(yǎng)14天后,行油紅O染色,觀察細(xì)胞分化結(jié)果。 結(jié)果分離培養(yǎng)的細(xì)胞2-3天后呈多形性貼壁生長并開始大量增殖,3代以后的細(xì)胞呈均一的成纖維細(xì)胞樣形態(tài)。免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示,細(xì)胞表面分子CD44陽性,CD34、CD45陰性。細(xì)胞周期檢測結(jié)果顯示,(80.13±1.24)%的第3代BMSC處于G1期。細(xì)胞加成脂誘導(dǎo)劑后14天經(jīng)油紅O染色可見胞質(zhì)內(nèi)有橙紅色的脂滴。 結(jié)論采用全骨髓貼壁培養(yǎng)法可以方便、快捷地獲得BMSC,并且在體外培養(yǎng)條件下能大量增殖,經(jīng)誘導(dǎo)后可以向脂肪細(xì)胞分化,具有干細(xì)胞的生物學(xué)特性,是一種比較理想的體外培養(yǎng)方法。 第二部分骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對急性肝衰竭大鼠腸源性內(nèi)毒素血癥的影響 實(shí)驗(yàn)一急性肝衰竭大鼠伴腸源性內(nèi)毒素血癥模型的建立 目的探討用不同劑量硫代乙酰胺(Thioacetamide, TAA)制作ALF大鼠伴IETM模型的量-效關(guān)系。 方法設(shè)立3個(gè)TAA劑量組,每組10只,分別以200、400、600 mg/(kg·d)劑量的TAA灌胃,24h后相同劑量TAA重復(fù)灌胃一次,建立不同劑量TAA致大鼠IETM的動物模型,并設(shè)立對照組,以等體積0.9%氯化鈉溶液灌胃。觀察造模后24h、48h大鼠的死亡率,48h后剩余大鼠腹主動脈采血檢測血清中丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)及血漿內(nèi)毒素含量,取部分肝臟及回腸組織作常規(guī)HE染色,光鏡下觀察肝臟及回腸組織的病理變化。 結(jié)果不同劑量TAA組大鼠在肝損傷評分、ALT、AST、內(nèi)毒素水平方面與對照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。TAA劑量越大,死亡率越高,肝損評分、ALT、AST及內(nèi)毒素水平也越高。200mg/kg TAA模型組肝壞死不明顯,400mg/kg TAA模型組與600mg/kg TAA模型組有明顯肝壞死,ALT、AST及內(nèi)毒素水平與200mg/kg TAA組相比明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。不同劑量TAA模型組有不同程度的腸粘膜損傷。 結(jié)論TAA致肝損傷具有明顯的劑量依賴性,其中400 mg/(kg·d)TAA劑量為制備ALF伴IETM模型的適宜劑量。 實(shí)驗(yàn)二骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對急性肝衰竭大鼠內(nèi)毒素及細(xì)胞因子的影響 目的探討B(tài)MSC移植對TAA所致ALF大鼠內(nèi)毒素及TNF-α、IL-10的影響。 方法雌性Wistar大鼠30只,體重250±10g,隨機(jī)分為對照組、TAA模型組和TAA+BMSC治療組,每組10只。采用TAA 400mg/kg灌胃,24h后重復(fù)灌胃建立ALF大鼠模型,對照組給予0.9%氯化鈉溶液2m1灌胃；第二次灌胃后將BMSC(1×106個(gè)細(xì)胞/只)經(jīng)尾靜脈移植到TAA+BMSC治療組大鼠體內(nèi),對照組和TAA模型組大鼠經(jīng)尾靜脈給予等量無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)。BMSC治療72h后將大鼠麻醉狀態(tài)下腹主動脈采血,檢測血清中ALT、AST以及血漿內(nèi)毒素含量,ELISA法檢測血漿及肝組織勻漿中TNF-α、IL-10含量。取部分肝組織及回腸組織作常規(guī)病理檢查。 結(jié)果TAA模型組與對照組比較,大鼠血清ALT、AST、血漿內(nèi)毒素、血漿與肝組織TNF-α、IL-10水平均顯著上升(P0.05), TNF-α/IL-10的比值明顯升高。TAA+BMSC治療組與TAA模型組相比大鼠血清ALT、AST以及血漿內(nèi)毒素水平均顯著降低,血漿與肝組織IL-10水平明顯升高,TNF-α/IL-10的比值明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。TAA+BMSC治療組與對照組相比,血漿與肝組織TNF-α/IL-10的比值無明顯差異(P0.05)。病理切片顯示BMSC能夠明顯減輕TAA對肝組織的損害,TAA模型組及TAA+BMSC治療組回腸組織病理顯示均有不同程度損害。 結(jié)論TAA造模形成的ALF大鼠伴有IETM, BMSC尾靜脈移植對ALF大鼠IETM有一定的保護(hù)作用,可以調(diào)節(jié)促炎與抗炎因子達(dá)到新的平衡,這可能是BMSC移植治療ALF的作用機(jī)制之一。 第三部分骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對急性肝衰竭大鼠腸源性內(nèi)毒素血癥治療作用機(jī)制的研究 實(shí)驗(yàn)一骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對脂多糖刺激枯否細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響 目的探討在體外條件下BMSC對脂多糖(LPS)刺激后大鼠肝臟枯否細(xì)胞(KC)分泌TNF-α的影響。 方法采用全骨髓貼壁培養(yǎng)法分離、純化大鼠BMSC,原位灌流、Percoll密度梯度離心法原代分離培養(yǎng)肝KC,取體外培養(yǎng)48h后的KC用于實(shí)驗(yàn),用LPS(終濃度1μg/ml)刺激KC,BMSC加入KC中建立BMSC共培養(yǎng)體系,實(shí)驗(yàn)分為四組：①KC組；②KC+LPS組；③KC+LPS+BMSC組；④KC+LPS+BMSC培養(yǎng)上清組。LPS作用24h、48h、72h后收集培養(yǎng)上清檢測培養(yǎng)體系中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的水平。 結(jié)果無LPS刺激時(shí),正常肝臟KC培養(yǎng)上清中可檢測到少量TNF-α,經(jīng)LPS刺激后KC培養(yǎng)上清中TNF-α含量明顯上升；而與BMSC共培養(yǎng)時(shí),TNF-α含量顯著減少(P0.05)；KC與BMSC培養(yǎng)上清共培養(yǎng)時(shí),TNF-α含量與②組相比明顯減少,與③組相比TNF-α含量較高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 結(jié)論BMSC可以抑制LPS刺激后大鼠肝臟KC的活化,減少TNF-α的分泌,BMSC培養(yǎng)上清同樣可以抑制KC的活化,但作用比BMSC弱。 實(shí)驗(yàn)二骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對急性肝衰竭大鼠CD14、NF-κB的影響 目的觀察BMSC移植對ALF大鼠肝組織中內(nèi)毒素受體CD14及核因子NF-κB表達(dá)的影響。 方法30只雌性Wistar大鼠,體重250±10g,隨機(jī)分為對照組、TAA模型組和TAA+BMSC治療組,每組10只,BMSC移植治療72h后將各組存活大鼠麻醉,腹主動脈采血后取部分肝組織備檢。SABC免疫組化法檢測肝組織中內(nèi)毒素受體CD14及核因子NF-κB的表達(dá)。 結(jié)果對照組肝組織可見少量CD14、NF-κB表達(dá)陽性的細(xì)胞。TAA模型組與對照組相比,CD14、NF-κB表達(dá)明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。經(jīng)BMSC治療后,CD14、NF-κB表達(dá)比TAA模型組明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),與對照組相比,BMSC治療組CD14、NF-κB仍然很高,差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 結(jié)論BMSC移植可以抑制肝組織CD14及NF-κB的表達(dá)。BMSC移植可能通過抑制內(nèi)毒素受體CD14及核因子NF-κB的表達(dá)來阻斷內(nèi)毒素在體內(nèi)發(fā)揮效應(yīng)。
【圖文】：

表3各組大鼠血清ALT、AST濃度及血漿內(nèi)毒素水平比較(x士s)組別nALT(U/L)AST(U/L)ET(EU/m對照組1047.81士22.6169，33士22.040.103士0.0Zoomg/kgTAA模型組8305.09士116.78八465.58士139.96八0.436士0.0400mg/kgTAA模型組5901.67士274.31‘空、*584.37士250.90‘、*0.550士0.096O0mg/kgTAA模型組2一454.84士473.49△*米1589.23士159.67八*米0.620士0.05:“只0.05，”對照組;女只0.05”Zoomg/kgT從組;冰代0.05叮400mg/kgT從組表4內(nèi)毒素與ALT、AsT的相關(guān)性項(xiàng)目r值尸值A(chǔ)LI…AST0.5030.0010.7100.0002500

圖28各組大鼠血槳內(nèi)毒素水平比較討論大量研究表明，各種肝病均伴有不同程度的腸源性內(nèi)毒素血癥(IniestinalEndotoxemia，TM)，而IETM是更為重要的致肝損傷因素Il]，對于IETM的研究一直是基礎(chǔ)與臨床的要課題。建立穩(wěn)定的IETM動物模型則是研究IETM的病理生理以及探討其防治措施的基礎(chǔ)與前題。目前報(bào)道較多的1’AA致大鼠ALF模型具有良好的重復(fù)性和可行性，而且1人A在引起肝損傷的同時(shí)內(nèi)毒素水平升高12一3]，更符合臨床實(shí)際，是研究急性肝損傷常用的動物模型。然而，以往所用的TAA劑量從150一600m叭g體重不等，給藥方式有皮下注射、腹腔注射及灌胃等，對所造模型的評價(jià)也無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)陣8]。本實(shí)驗(yàn)通過給予不同劑量TAA灌胃，觀察動物成模的情況，，摸索一個(gè)適宜的造模劑量，為肝損傷伴IETM的防治研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。rl人A是一種肝毒性藥物，可激活磷脂酶AZ，使溶血卵磷脂產(chǎn)生增加，破壞肝細(xì)胞膜
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R575.3

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 江敏華;間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫調(diào)控在治療肝衰竭中的作用及機(jī)制探討[D];蘇州大學(xué);2011年

本文編號：2656114