【摘要】：乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)是引起肝硬化和肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma)的一個(gè)主要因素,乙型肝炎病毒感染是一個(gè)全球性的健康問題。有研究人員比較HepG2和HepG2.2.15兩個(gè)肝癌細(xì)胞系的基因表達(dá)譜后發(fā)現(xiàn),在HBV整合的HepG2.2.15細(xì)胞系中,有數(shù)個(gè)基因的表達(dá)量比HepG2細(xì)胞要高。這些基因包括了一些干擾素誘導(dǎo)的基因,其中包括可以被干擾素γ誘導(dǎo)的基因MVP。MVP基因編碼主要穹窿蛋白(major vault protein),它是構(gòu)成穹窿體(vault)的主要成分。既然MVP的表達(dá)可以被HBV上調(diào),說明MVP也許參與到病毒與宿主細(xì)胞的相互作用中。目前還沒有文獻(xiàn)報(bào)道MVP與乙型肝炎病毒感染之間的聯(lián)系。 為了研究探討MVP與HBV感染之間的相互關(guān)系,我們首先檢測了健康人與乙肝病人血清中MVP的水平差異。經(jīng)過ELISA檢測,我們發(fā)現(xiàn)乙型肝炎病人血清中MVP的含量(109.19±55.14ng/ml)較之健康人血清中的含量(62.48±22.94ng/ml)明顯要高。為探討HBV上調(diào)MVP的機(jī)制,我們通過PCR獲得了MVP基因的啟動(dòng)子,將其構(gòu)建到含luciferase報(bào)告基因的質(zhì)粒pGL3-basic,通過報(bào)告基因檢測系統(tǒng),我們發(fā)現(xiàn)HBV能上調(diào)MVP啟動(dòng)子的活性,進(jìn)一步采用Western Blot檢測了HBV對MVP的調(diào)節(jié),結(jié)果顯示,HBV在蛋白水平上上調(diào)MVP的水平。 為了研究HBV感染與MVP之間的關(guān)系,我們將MVP的編碼區(qū)構(gòu)建到了真核表達(dá)載體pCMV-Tag2B中,采用HBV的感染性克隆pHBV1.3感染細(xì)胞以產(chǎn)生HBV病毒,通過用ELISA法檢測被感染細(xì)胞上清中HBsAg和HBeAg水平,并用熒光定量PCR法檢測感染細(xì)胞中HBV復(fù)制中間體DNA水平,并用Northern Blot檢測了RNA水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn)MVP蛋白在細(xì)胞水平能夠促進(jìn)HBV的表達(dá)和復(fù)制。此外,我們構(gòu)建了針對MVP的shRNA,發(fā)現(xiàn)當(dāng)MVP的表達(dá)被干擾之后,HBV的復(fù)制水平被抑制,從另一方面也證明了MVP對HBV的復(fù)制起到促進(jìn)作用。 接著我們想探討MVP調(diào)控HBV的復(fù)制的分子機(jī)制。于是將MVP與HBV全長啟動(dòng)子轉(zhuǎn)染到HepG2細(xì)胞中,發(fā)現(xiàn)MVP可以上調(diào)HBV全長啟動(dòng)子的活性。在HBV全長啟動(dòng)子上有一些轉(zhuǎn)錄因子作用位點(diǎn),包括Stat3,HNF-1,Sp1,C/EBP等。文獻(xiàn)報(bào)道Stat3參與人類多種腫瘤的發(fā)生及發(fā)展進(jìn)程,因此我們希望研究一下在MVP對HBV的調(diào)控中,Stat3是否也參與其中。通過干擾RNA實(shí)驗(yàn),我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)將HepG2細(xì)胞中的Stat3干擾掉后,MVP對HBV全長啟動(dòng)子的上調(diào)作用被削弱,說明Stat3在MVP對HBV全長啟動(dòng)子的調(diào)控過程中有一定的作用。接著我們就通過ChIP實(shí)驗(yàn)證實(shí)MVP可以增強(qiáng)Stat3與HBV全長啟動(dòng)子上對應(yīng)結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合。最后我們用Western Blot實(shí)驗(yàn)證實(shí),過表達(dá)MVP可以上調(diào)細(xì)胞中Stat3的表達(dá),并且MVP可以促進(jìn)Stat3從細(xì)胞質(zhì)到細(xì)胞核的轉(zhuǎn)移。這都說明,在MVP對HBV全長啟動(dòng)子的調(diào)控過程中,Stat3起到了非常重要的作用。 干擾素a是用于治療乙型肝炎病毒感染的常用藥物,由于文獻(xiàn)報(bào)道MVP與細(xì)胞的耐藥性相關(guān),我們研究了MVP對于干擾素對病毒的抑制作用的影響,首先我們檢測了在MVP存在的情況下,干擾素α對乙肝病毒S和E蛋白的抑制情況,發(fā)現(xiàn)過表達(dá)MVP時(shí),干擾素a對乙肝病毒S蛋白和E蛋白的合成的抑制作用減弱。接著我們用熒光定量PCR技術(shù)檢測了干擾素下游的幾個(gè)抗病毒基因PKR,2'-5'OAS,MxA的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)MVP在一定程度上對這幾個(gè)基因有抑制作用。所以推測MVP在干擾素抗病毒過程中有著一定負(fù)調(diào)控作用。 由于MVP在各種癌細(xì)胞中的表達(dá)量普遍較高,而且文獻(xiàn)報(bào)道MVP與細(xì)胞耐藥性相關(guān),我們認(rèn)為本研究為HBV的致病機(jī)理提供了新的證據(jù),同時(shí)為HBV的基因治療奠定了一定的理論基礎(chǔ)。
【圖文】：

慢性HBV感染的不同階段(SurakitP,2007)

電鏡冷凍燭刻技術(shù)得到的穹Xu體結(jié)構(gòu)圖
【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R512.62

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：2655111