發(fā)布時間：2020-05-07 01:40

【摘要】：目的探究炎癥狀態(tài)下自噬相關蛋白p62和ATG16L1對腸上皮細胞(IECs)趨化因子表達的調控及其機制。方法培養(yǎng)Caco-2細胞建立腸上皮細胞模型。使用白介素-1β(IL-1β)建立炎癥性腸病(IBD)體外模型。運用Western blot技術檢測p62、p65、ATG16L1、微管相關蛋白1輕鏈3(LC3)、核因子-κB(NF-κB)以及絲裂原激活的蛋白激酶(MAPK)的表達;運用Real-time PCR技術檢測p62、白介素-8(IL-8)和單核細胞趨化蛋白1(MCP-1)的mRNA水平;運用ELISA技術檢測IL-8和MCP-1的分泌;使用小干擾RNA(siRNA)下調p62、p65和ATG16L1的表達。結果1.IL-1β調控腸上皮細胞p62表達的機制研究IL-1β刺激細胞后,p62蛋白表達增加,而自噬標志蛋白LC3B-II無明顯改變,提示p62的增加與自噬過程受抑制無關。IL-1β促進p62 mRNA表達上調,提示p62的增加與激活轉錄有關。使用蛋白合成抑制劑cycloheximide處理細胞后,IL-1β誘導的p62表達被抑制,而使用自噬抑制劑bafilomycin A1處理細胞后,IL-1β誘導的p62表達明顯升高,表明IL-1β是通過促進轉錄和蛋白合成引起p62上調。使用siRNA下調p65抑制NF-κB的激活,IL-1β誘導的p62表達下降,表明NF-κB調控p62表達。2.p62調控腸上皮細胞趨化因子表達的機制研究IL-1β刺激細胞后,NF-κB與MAPK通路均激活,而p62表達的升高伴隨NF-κB的激活,提示p62可能參與調控NF-κB的激活。使用siRNA下調p62,NF-κB的激活受到抑制,證明p62調控NF-κB的激活。使用siRNA下調p65抑制NF-κB激活,IL-1β誘導的IL-8和MCP-1表達均下降,表明IL-8和MCP-1的表達受NF-κB調節(jié)。使用siRNA下調p62,IL-1β誘導的IL-8和MCP-1表達也出現(xiàn)了下降。加入自噬抑制劑bafilomycin A1上調p62,IL-1β誘導的IL-8和MCP-1表達均明顯增加,以上結果表明p62促進IL-1β誘導的趨化因子IL-8和MCP-1表達,該過程通過NF-κB介導。3.ATG16L1調控腸上皮細胞趨化因子表達使用siRNA下調ATG16L1,IL-1β誘導的IL-8和MCP-1表達均增加,表明ATG16L1負性調控IL-1β誘導的IL-8和MCP-1表達。結論在炎癥性腸病細胞模型中,IL-1β通過激活NF-κB促進p62表達,而p62通過增強NF-κB激活促進IL-1β誘導的趨化因子表達。ATG16L1負性調控IL-1β誘導的趨化因子表達,其機制有待進一步研究。
【圖文】：

圖 1-1 IL-1β 促進 p62 表達A. IL-1β（1ng/ml 和 10ng/ml）分別處理細胞，不同時間點 p62 蛋白的表達；B．IL-1β（10ng/ml）刺激細胞，不同時間點 LC3B 蛋白的表達；C．IL-1β（10ng/ml）刺激細胞，不同時間點 p62 mRNA 的表達；（A-C）** P < 0.01，*** P < 0.001，ns 表示統(tǒng)計學無差異，，均與對照組相比。D．使用蛋白合成抑制劑 cycloheximide（10μM）處理細胞，加入 IL-1β 后不同時間點 p62 蛋白的表達；E．自噬抑制劑 bafilomycin A1（100nM）處理細胞，加入 IL-1β 后不同時間點 p62 蛋白的表達；（D-E）*** P< 0.001

在先前的研究中，我們證明了在腸上皮細胞中 IL-1β 通過增加轉錄和蛋白合成引起 p62蛋白上調，但是 p62 蛋白的上調受何種因子調控還不清楚。我們從經典的轉錄因子 NF-κB入手，探究 NF-κB 是否調控 p62 蛋白的表達。將 NF-κB 亞基 p65 的 siRNA 轉染進入細胞，Western blot 顯示 p65 蛋白表達下降，證明 siRNA 有效（圖 1-2 A）。敲減 p65 抑制 IL-1β 誘導的 p62 mRNA 和蛋白表達上調（圖 1-2 B-C），表明 p62 蛋白的表達受 NF-κB 調節(jié)。
【學位授予單位】：上海交通大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R574

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本文編號：2652214