【摘要】：目的探究炎癥狀態(tài)下自噬相關(guān)蛋白p62和ATG16L1對腸上皮細(xì)胞(IECs)趨化因子表達(dá)的調(diào)控及其機制。方法培養(yǎng)Caco-2細(xì)胞建立腸上皮細(xì)胞模型。使用白介素-1β(IL-1β)建立炎癥性腸病(IBD)體外模型。運用Western blot技術(shù)檢測p62、p65、ATG16L1、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3)、核因子-κB(NF-κB)以及絲裂原激活的蛋白激酶(MAPK)的表達(dá);運用Real-time PCR技術(shù)檢測p62、白介素-8(IL-8)和單核細(xì)胞趨化蛋白1(MCP-1)的mRNA水平;運用ELISA技術(shù)檢測IL-8和MCP-1的分泌;使用小干擾RNA(siRNA)下調(diào)p62、p65和ATG16L1的表達(dá)。結(jié)果1.IL-1β調(diào)控腸上皮細(xì)胞p62表達(dá)的機制研究IL-1β刺激細(xì)胞后,p62蛋白表達(dá)增加,而自噬標(biāo)志蛋白LC3B-II無明顯改變,提示p62的增加與自噬過程受抑制無關(guān)。IL-1β促進p62 mRNA表達(dá)上調(diào),提示p62的增加與激活轉(zhuǎn)錄有關(guān)。使用蛋白合成抑制劑cycloheximide處理細(xì)胞后,IL-1β誘導(dǎo)的p62表達(dá)被抑制,而使用自噬抑制劑bafilomycin A1處理細(xì)胞后,IL-1β誘導(dǎo)的p62表達(dá)明顯升高,表明IL-1β是通過促進轉(zhuǎn)錄和蛋白合成引起p62上調(diào)。使用siRNA下調(diào)p65抑制NF-κB的激活,IL-1β誘導(dǎo)的p62表達(dá)下降,表明NF-κB調(diào)控p62表達(dá)。2.p62調(diào)控腸上皮細(xì)胞趨化因子表達(dá)的機制研究IL-1β刺激細(xì)胞后,NF-κB與MAPK通路均激活,而p62表達(dá)的升高伴隨NF-κB的激活,提示p62可能參與調(diào)控NF-κB的激活。使用siRNA下調(diào)p62,NF-κB的激活受到抑制,證明p62調(diào)控NF-κB的激活。使用siRNA下調(diào)p65抑制NF-κB激活,IL-1β誘導(dǎo)的IL-8和MCP-1表達(dá)均下降,表明IL-8和MCP-1的表達(dá)受NF-κB調(diào)節(jié)。使用siRNA下調(diào)p62,IL-1β誘導(dǎo)的IL-8和MCP-1表達(dá)也出現(xiàn)了下降。加入自噬抑制劑bafilomycin A1上調(diào)p62,IL-1β誘導(dǎo)的IL-8和MCP-1表達(dá)均明顯增加,以上結(jié)果表明p62促進IL-1β誘導(dǎo)的趨化因子IL-8和MCP-1表達(dá),該過程通過NF-κB介導(dǎo)。3.ATG16L1調(diào)控腸上皮細(xì)胞趨化因子表達(dá)使用siRNA下調(diào)ATG16L1,IL-1β誘導(dǎo)的IL-8和MCP-1表達(dá)均增加,表明ATG16L1負(fù)性調(diào)控IL-1β誘導(dǎo)的IL-8和MCP-1表達(dá)。結(jié)論在炎癥性腸病細(xì)胞模型中,IL-1β通過激活NF-κB促進p62表達(dá),而p62通過增強NF-κB激活促進IL-1β誘導(dǎo)的趨化因子表達(dá)。ATG16L1負(fù)性調(diào)控IL-1β誘導(dǎo)的趨化因子表達(dá),其機制有待進一步研究。
【圖文】：

圖 1-1 IL-1β 促進 p62 表達(dá)A. IL-1β（1ng/ml 和 10ng/ml）分別處理細(xì)胞，不同時間點 p62 蛋白的表達(dá)；B．IL-1β（10ng/ml）刺激細(xì)胞，不同時間點 LC3B 蛋白的表達(dá)；C．IL-1β（10ng/ml）刺激細(xì)胞，不同時間點 p62 mRNA 的表達(dá)；（A-C）** P < 0.01，*** P < 0.001，ns 表示統(tǒng)計學(xué)無差異，，均與對照組相比。D．使用蛋白合成抑制劑 cycloheximide（10μM）處理細(xì)胞，加入 IL-1β 后不同時間點 p62 蛋白的表達(dá)；E．自噬抑制劑 bafilomycin A1（100nM）處理細(xì)胞，加入 IL-1β 后不同時間點 p62 蛋白的表達(dá)；（D-E）*** P< 0.001

在先前的研究中，我們證明了在腸上皮細(xì)胞中 IL-1β 通過增加轉(zhuǎn)錄和蛋白合成引起 p62蛋白上調(diào)，但是 p62 蛋白的上調(diào)受何種因子調(diào)控還不清楚。我們從經(jīng)典的轉(zhuǎn)錄因子 NF-κB入手，探究 NF-κB 是否調(diào)控 p62 蛋白的表達(dá)。將 NF-κB 亞基 p65 的 siRNA 轉(zhuǎn)染進入細(xì)胞，Western blot 顯示 p65 蛋白表達(dá)下降，證明 siRNA 有效（圖 1-2 A）。敲減 p65 抑制 IL-1β 誘導(dǎo)的 p62 mRNA 和蛋白表達(dá)上調(diào)（圖 1-2 B-C），表明 p62 蛋白的表達(dá)受 NF-κB 調(diào)節(jié)。
【學(xué)位授予單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R574

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本文編號：2652214