【摘要】：目的:乙型肝炎病毒(HBV)感染是個全球性問題,我國是公認(rèn)的乙型肝炎病毒(HBV)感染高流行區(qū)。隨著對乙型肝炎病毒的結(jié)構(gòu)及功能研究的深入,以病毒為靶點(diǎn)的藥物研究逐漸引起人們的重視。為此我們比對了HBV各個亞型,選擇了其保守區(qū),利用生物信息學(xué)的軟件設(shè)計(jì)了批反義寡核苷酸,對其抗HBV活性進(jìn)行了篩選并對其靶位點(diǎn)進(jìn)行了優(yōu)化,目的在于找到新的病毒作用靶標(biāo)。但是由于HBV基因組較小,易發(fā)生突變,限制了靶向病毒的抗病毒藥物的發(fā)展。與病毒基因組相比,人類基因組序列中可能包括更多與病毒復(fù)制有關(guān)的基因,抑制這些基因的功能可能阻斷病毒感染。些研究結(jié)果也證明抑制這些與HBV復(fù)制相關(guān)的宿主基因的表達(dá)可阻斷HBV病毒的感染。本研究利用反義寡核苷酸技術(shù)篩選和驗(yàn)證病毒及宿主細(xì)胞內(nèi)潛在的抗HBV藥物作用靶標(biāo),為新型抗病毒藥物的篩選奠定基礎(chǔ)。 方法:本實(shí)驗(yàn)通過生物信息學(xué)分析設(shè)計(jì)了批針對HBV RNA的反義寡核苷酸,同時基于生物信息學(xué)的預(yù)測,結(jié)合病毒宿主相互作用網(wǎng)絡(luò),構(gòu)建了個HBV復(fù)制相關(guān)基因網(wǎng)絡(luò),并根據(jù)GeneBank中的各基因核酸序列mRNA,利用Antisense design對這些基因進(jìn)行基于多預(yù)測RNA二級結(jié)構(gòu)的計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì),通過與GeneBank聯(lián)機(jī)blast序列比對獲得了理論上靶向上述基因的反義寡核苷酸各5條,在HepG2.2.15細(xì)胞模型上通過ELISA,RT-PCR、Western印跡技術(shù)篩選及驗(yàn)證對HBV復(fù)制的影響。 結(jié)果:通過在HepG2.2.15細(xì)胞模型上的抗HBV反義寡核苷酸的篩選,從病毒靶向的30多條反義序列中篩選出了3條具有抗HBV活性的反義寡核苷酸,同時從40多個與HBV復(fù)制相關(guān)的基因中篩選出了2個潛在的抗HBV藥物作用靶標(biāo)。 病毒靶向的反義寡核苷酸活性篩選結(jié)果顯示:序列self1820、self1852和self2057對HepG2.2.15細(xì)胞上清中的HBsAg和HBeAg有明顯的抑制作用,且細(xì)胞毒性檢測實(shí)驗(yàn)顯示反義序列self1820、self1852和self2057在給藥濃度為0.2μM-6.4μM范圍內(nèi)不影響HepG2.2.15細(xì)胞增殖。 宿主靶標(biāo)的活性篩選結(jié)果發(fā)現(xiàn):分別靶向COX6A1(細(xì)胞色素c氧化酶亞基VI a肽1 cytochrome c oxidase subunit Via polypeptide 1)[2]和PPARα(過氧化物酶體增殖活化受體α, peroxisome proliferative activated receptor, alpha)的反義寡核苷酸序列COX6A1-2和PPARα-2能顯著抑制HepG2.2.15細(xì)胞上清中的HBsAg和HBeAg的分泌,并呈現(xiàn)良好的劑量依賴關(guān)系。同時COX6A1-2和PPARα-2還可特異性并劑量依賴的抑制HepG2.2.15細(xì)胞中COX6A1和PPARαmRNA及蛋白的表達(dá)。上述研究結(jié)果初步確定了COX6A1和PPARα可能成為抗HBV新型作用靶點(diǎn)。 結(jié)論:通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)靶向HBV自身的反義序列self1820、self1852和self2057具有良好的抗HBV活性,同時本研究通過篩選和初步驗(yàn)證確定了COX6A1和PPARα可能成為抗HBV新型作用靶點(diǎn)。
【圖文】：

抗乙型肝炎病毒潛在藥物靶標(biāo)的篩選和驗(yàn)證 第 部分28 self1641 20 TCC ACC ACG AGT CTA GAC TC29 self1008 20 TCTTGTTCCCAAGAATATGG30 self615 20 CTAACATTGAGATTCCCGAG31 self43 20 ACAGCTTGGAGGCTTGAACA2、 HepG2.2.15 細(xì)胞培養(yǎng)液中 HBsAg、HBeAg 的 ELISA 檢測ASODN 分別以 0.8μ M 給藥處理 HepG2.2.15 細(xì)胞，72h 后收集細(xì)胞培養(yǎng)液,ELISA 方法檢測 HBsAg、HBeAg 的分泌情況，結(jié)果見圖 1,2。

2、 HepG2.2.15 細(xì)胞培養(yǎng)液中 HBsAg、HBeAg 的 ELISA 檢測ASODN 分別以 0.8μ M 給藥處理 HepG2.2.15 細(xì)胞，72h 后收集細(xì)胞培養(yǎng)液,ELISA 方法檢測 HBsAg、HBeAg 的分泌情況，，結(jié)果見圖 1,2。圖 1 1-17 號 ASODN 對 Hep2.2.15 細(xì)胞中 HBsAg 和 HBeAg 的抑制作用
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R512.62

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2651849