【摘要】： 背景/目的 幽門螺桿菌(Helicobacter pylori,Hp)感染是慢性活動性胃炎和消化性潰瘍的主要病因；與胃腺癌、胃黏膜相關(guān)性淋巴樣組織淋巴瘤(MALT)的發(fā)生亦密切相關(guān)，世界衛(wèi)生組織屬下的癌癥研究委員會1994年已將其列為Ⅰ類致癌原。臨床現(xiàn)有的根除Hp的手段主要是聯(lián)合應(yīng)用抗生素，但由于該菌感染的普遍性、耐藥菌株的不斷增加、較高的花費(fèi)以及病人的低依從性等，限制了抗菌藥物的療效，進(jìn)行免疫防治研究十分迫切。鑒于目前Hp疫苗研制中須使用黏膜免疫佐劑霍亂毒素(CT)或不耐熱腸毒素(LT)，限制了疫苗在人體中的應(yīng)用。因此本研究的目的是：選擇Hp尿素酶B亞單位(UreB)和過氧化氫酶(Kat)為靶抗原，應(yīng)用基因工程技術(shù)分別構(gòu)建重組UreB(rUreB)和重組Kat(rKat)原核表達(dá)體系，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)快速蛋白質(zhì)液相色譜系統(tǒng)(FPLC)純化后，逆向蒸發(fā)法制備重組蛋白的脂質(zhì)體疫苗，并在BALB/c小鼠模型中評價其對Hp感染的免疫保護(hù)作用，并對其免疫保護(hù)機(jī)制進(jìn)行探討。 方法 1．運(yùn)用PCR技術(shù)從Hp總DNA中擴(kuò)增出UreB結(jié)構(gòu)基因，裝入pT(pGEM-T-easy vector)載體進(jìn)行序列分析，將UreB基因亞克隆入表達(dá)載體pET-22b(+)并在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)，采用FPLC系統(tǒng)經(jīng)Sephacyl S-200凝膠過濾和Sepharose Fast Flow陰離子交換兩步層析獲得純化rUreB，免疫印跡法檢測抗原性。15L發(fā)酵罐發(fā)酵制備mg級以上的重組蛋白。 2．運(yùn)用PCR技術(shù)從Hp總DNA中擴(kuò)增出Kat結(jié)構(gòu)基因，裝入pET-22b(+)載體進(jìn)行序列分析，并在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)，貝爾斯-西策爾斯Beers Sizers)法測定重組過氧化氫酶活性，表達(dá)Kat的包涵體經(jīng)分離、洗滌、溶解、復(fù)性，采用FPLC系統(tǒng)經(jīng)Sepharose Fast Flow陰離子交換、Octyl-Sepharose-4FF疏水層析、Sephacyl S-200凝膠過濾 2003級博士研究生論文 層析獲得純化的rKat，。 3.用逆向蒸發(fā)法制備以卵磷脂和膽固醇為膜組分包裹的重組蛋白和 有/無免疫佐劑的口服疫苗，并用透射電鏡測定其粒徑。BALB/c小鼠分 為6組，分別通過灌胃方法給予PBS、空白脂質(zhì)體、UreB重組蛋白+CT、 脂質(zhì)體包裹UreB重組蛋白、脂質(zhì)體包裹UreB重組蛋白和CT、脂質(zhì)體 包裹(ureB十Kat+cT)，每周1次共4次，末次攻擊2周再用活HP攻擊3 次，5周后處死小鼠，行胃組織快速尿素酶試驗(yàn)、你的定植半定量、炎 癥程度及其炎癥活動度的評分。RT一PCR檢測小鼠脾淋巴細(xì)胞中丫一干擾 素(工NF一丫)和白細(xì)胞介素一4(工L一4)表達(dá)。 結(jié)果 1.成功構(gòu)建了ureB重組質(zhì)粒pT一ureB，序列分析顯示UreB結(jié)構(gòu)基 因由17lobp組成，開放讀框完整無中斷，與GeneBank中ureB編碼序 列(M60398，HP ureB)進(jìn)行比較，其同源性為97.0%(1658/1710)， pET一22b(+)心reB經(jīng) Notl和xhol雙酶切后顯示，重組質(zhì)粒載體構(gòu)建成 功。SDS一PAGE顯示表達(dá)產(chǎn)物相對分子量約為64kD，可溶性表達(dá)蛋白占 全菌蛋白的18%以上，純化后獲得純度達(dá)95%的重組蛋白，免疫印跡顯 示該蛋白可被抗尿素酶B亞單位單抗所識別。 2.成功構(gòu)建了Kat重組質(zhì)粒pET一22b(+)/Kat，序列分析顯示kat結(jié) 構(gòu)基因由1512bp組成，開放讀框完整無中斷，與GencBank公布的Hp 過氧化氫酶編碼序列一致，SDS一PAGE顯示表達(dá)產(chǎn)物相對分子量約為 58kD，以包涵體為主的重組過氧化氫酶蛋白占菌體總蛋白的24.4%，純 化后獲得純度達(dá)96%的重組蛋白，并顯示有良好過氧化氫酶活性。 3，成功制備了不同組分的脂質(zhì)體疫苗，電鏡下負(fù)染顯示粒徑為0.7 士0.2“m。PBS組、空白脂質(zhì)體組、rUreB+CT組、脂質(zhì)體包裹rUreB組、 脂質(zhì)體包裹rureB+eT組、脂質(zhì)體包裹(rureB+水a(chǎn)t+eT)組的免疫保護(hù)率 分別為0(o/11)、o(0/一1)、55.3%(7/12)、54.5%(621一)、63.6%(7八1)、 83.3%(10/12)，ureB重組蛋白+cT組免疫保護(hù)率與脂質(zhì)體包裹UreB重 組蛋白組比較無顯著性差異印。.05)，脂質(zhì)體包裹ureB重組蛋白十cT組 免疫保護(hù)率與脂質(zhì)體包裹(rureB十rKat十cT)組比較有顯著性差異 (P0.05)。各疫苗組HP定植評分均明顯低于PBs和脂質(zhì)體對照組 南方醫(yī)院全軍消化病研究所 2003級博士研究生論文 (P0.ol)，且UreB+Kat雙價疫苗組較三個單價疫苗組比較也有顯著性 差異護(hù)0.05)。疫苗組不僅能降低HP的定植，而且能減輕你造成的小 鼠胃勃膜的局部慢性炎癥反應(yīng)(PO.05)，但各疫苗組間比較未見顯著性 差異(外0.05)。HP攻擊后，與對照組比較，各疫苗組脾淋巴細(xì)胞州F一Y mRNA水平較低(只0.05)，而工L一4mRNA水平則較高(只0.05)，各疫苗 組間比較未見顯著性差異(P0.05)。 結(jié)論 1.應(yīng)用基因重組技術(shù)構(gòu)建分別pET一22b(+)心reB和pET一22b(+)服at 重組質(zhì)粒，并在大腸桿菌中表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)快速蛋白質(zhì)液相色譜系統(tǒng) (FPLC)純化后，獲得了純化的重組蛋白，為HP疫苗的研制提供了物 質(zhì)基礎(chǔ); 2.首次用逆向蒸發(fā)法制備以卵磷脂和膽固醇為膜組分包裹的重組蛋 白口服疫苗，并在BALB/c小鼠HP感染模型中證實(shí)了脂質(zhì)體能代替霍亂 毒素的勃膜免疫佐劑作用; 3.動物實(shí)驗(yàn)證明HP疫苗能降低HP在小鼠胃內(nèi)的定植密度，同時 能減輕胃勃膜炎癥反應(yīng)程度，雙價疫苗較單價疫苗免疫保護(hù)作用更
【圖文】：

6.BL21印ET一UreB)after3hinduetionwith0.smMIPTG;7.BL21印ET一UreB)after3hinduetionwith0.smMIPTG;圖1一10重組蛋白含量掃描分析Fig.1一10Seananalysisoftheeontentofreeombinantprotein凝膠自動掃描分析，其重組尿素酶蛋白占菌體總蛋白的18.3%。南方醫(yī)院全軍消化病研究所

純化的重組蛋白進(jìn)行免疫印跡檢測，經(jīng)DAB顯色，結(jié)果顯示在64kD處，純化重組蛋白出現(xiàn)陽性條帶，，而BL21印ET一22b(+)/UreB)無IPTG誘導(dǎo)3h菌體為弱陽性反應(yīng)染色，而BLZI菌體無染色，見圖1一16，提示重組蛋白可被特異性抗尿素酶B亞單位單抗所識別。鑫{群撇撇潺琳卿繃64kD圖1一16重組ureB的免疫印跡分析Figl·16WesternbfotanalysisofU代Breeo班binan印rotein1.SonieatesuPernatantofBLZIafter3h2.SonieatesuPernatantofBL21(PET悶UreB)after3hwi比outIPTG;3·PurinedrUreB南方醫(yī)院全軍消化病研究所
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍第一軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2003
【分類號】：R57

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7 馬X;張

本文編號：2650755