【摘要】： 根據(jù)2006年全國范圍內(nèi)的血清流行病學(xué)調(diào)查資料,我國1～59歲人群中乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen,HBsAg)攜帶率已從1992年的9.75%降至7.18%,盡管HBsAg攜帶率降到8%以下,但由于我國人口基數(shù)龐大,按目前HBsAg攜帶率推算,我國仍然有HBsAg攜帶者約9300萬人,約占全世界慢性HBV感染者的1/4。其中慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)約為2000萬～3000萬例,全國每年死于乙肝相關(guān)肝病約30余萬例。所以對慢性HBV感染者特別是對處于非活動性HBsAg攜帶者(inactive HBsAg carrier,HBsAg-IaC)狀態(tài)的感染者的管理是一項重要而艱巨的任務(wù)。 HBV感染者可以打破免疫耐受清除乙型肝炎病毒e抗原(hepatitis B eantigen,HBeAg),產(chǎn)生乙型肝炎病毒e抗體(hepatitis B e antibody,anti-HBe),即發(fā)生HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換,發(fā)生HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換的群體中有67%-80%的人可以保持低水平的HBV DNA或HBV DNA檢測不到、ALT水平正常和輕度或不伴有肝組織壞死性炎癥的狀態(tài),這種被狀態(tài)定義為HBsAg-IaC狀態(tài)。HBsAg-IaC狀態(tài)可以是自發(fā)病情緩解而達到,也可以是核苷(酸)類似物(NA)或α干擾素抗病毒治療達到完全應(yīng)答后病情得以緩解和穩(wěn)定而達到,不管HBsAg-IaC狀態(tài)經(jīng)歷何種過程預(yù)后通常較好,是HBV感染者比較理想的維持狀態(tài)。 然而,即使長期保持穩(wěn)定攜帶狀態(tài),由于肝細(xì)胞核內(nèi)的共價閉合環(huán)狀DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA)很難被徹底清除,所以當(dāng)機體處于免疫虛損或免疫抑制狀態(tài)時或在病毒變異的情況下,病毒就會重新活動、復(fù)制,肝組織內(nèi)再次出現(xiàn)炎癥活動。曾有研究報道超過20%的HBsAg-IaCs進展為HBeAg陰性CHB[HBeAg negative chronic hepatitis B,HBeAg(-)CHB],而后者存在肝臟疾病反復(fù)活動、進展、發(fā)生肝硬化和肝細(xì)胞癌的風(fēng)險,約有23%和4%的HBeAg(-)CHB分別進展為肝硬化和肝癌。為了阻止HBsAg-IaCs向HBeAg(-)CHB發(fā)展的進程,首先弄清HBsAg-IaCs和HBeAg(-)CHB宿主和病毒學(xué)特征有無差異是很重要的。利用NA對HBeAg陽性慢性乙型肝炎[HBeAgpositive chronic hepatitis B,HBeAg(+)CHB]進行抗病毒治療,在藥物和機體免疫力的共同作用下HBV水平逐漸降低、HBeAg逐漸被清除,其中有相當(dāng)一部分人可以達到HBsAg-IaC狀態(tài),HBeAg(+)CHB經(jīng)NA治療達到完全應(yīng)答的患者(NCR-e+CHB)可以實現(xiàn)并藥物維持HBsAg-IaC狀態(tài),與自發(fā)形成HBsAg-IaC狀態(tài)的過程不同,為了發(fā)現(xiàn)NA抗病毒治療的療效與宿主和病毒的關(guān)系,認(rèn)識兩組人群的基本特征和各自的病毒學(xué)特點也很重要。就以上兩個問題我們進行了以下兩項臨床研究: 一.非活動性HBsAg攜帶者與HBeAg陰性慢性乙型肝炎患者病毒學(xué)特征的比較 1.1研究目的:為了探索HBsAg-IaCs向HBeAg(-)CHB進展的危險因素,對自然轉(zhuǎn)歸的HBsAg-IaCs和HBeAg(-)CHB兩組人群的HBV基因型、PC的G1896和BCP的A1762/G1764變異等病毒學(xué)特征分別進行比較。 1.2研究方法:按照2005年《慢性乙型肝炎防治指南》診斷標(biāo)準(zhǔn),進行HBsAg-IaCs和HBeAg(-)CHB患者的血清收集。采用QIAgen blood DNA檢測試劑盒(Qiagen,德國)分別對187例HBsAg-IaCs血清、99例HBeAg(-)CHB血清進行HBV DNA提取,然后利用半巢式PCR進行CX片段(nt1643-nt1974)擴增,半巢式PCR的第一輪引物分別為P9和P35,第二輪引物為P9和CSP,用CSP引物作測序引物,使用ABI 3730測序儀(Appliedbiosystems,美國)直接測序。HBV基因組第1762A/1764T以及第1896G核苷酸變異的判斷采用Cluster X進行序列排列和人工確認(rèn)�；蛐团袛嗖捎肞CR-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)方法,用PCR-RFLP方法判定不出基因型的標(biāo)本采用直接測序方法判斷(同研究二中基因型確定的方法)。 1.3研究結(jié)果:187例HBsAg-IaCs組中113例HBsAg-IaCs血清HBV DNA經(jīng)PCR擴增陽性,其中103份完成CX片段(nt1643-nt1974)測序,HBeAg(-)CHB組中99份血清全部HBV DNA PC擴增陽性,全部完成CX片段(nt1643-nt1974)測序。HBsAg-IaCs組中HBV基因B型比例高于HBeAg(-)CHB組(84/113 vs 46/99,74.3%vs 46.5%,P=0.000);HBsAg-IaCs組的G1896A變異比例高于HBeAg(-)CHB組(69/103 vs 39/99,67.0%vs 39.4%,P=0.000),但A1762T/G1764A變異株比例低于后者(38/103 vs 63/99,36.9%vs 63.6%,P=0.000)。經(jīng)二分類Logistic回歸分析得出男性(OR=7.519,95%CI=2.693-20.995,P=0.000)、年齡超過40歲(OR=25.369,95%CI=5.323-120.913,P=0.000)以及基因C型感染(OR=2.309,95%CI=1.028-5.186,P=0.043)是與HBeAg(-)CHB相關(guān)的危險因素的結(jié)論,并未發(fā)現(xiàn)A1762T/G1764A變異(OR=2.017,95%CI=0.958-4.247,P=0.065)與G1896A變異(OR=0.565,95%CI=0.265-1.205,P=0.140)有明顯的獨立預(yù)測HBeAg(-)CHB的作用。 1.4研究結(jié)論:HBsAg-IaC在病毒學(xué)特征上與HBeAg(-)CHB明顯不同;HBV基因C型(HBV/C)感染、年齡大的男性HBsAg-IaCs相對容易向HBeAg(-)CHB發(fā)展。 二.NA治療HBeAg(+)CHB完全應(yīng)答患者的病毒學(xué)特點 2.1研究目的:為了認(rèn)識NCR-e+CHB和HBsAg-IaC兩組人群HBsAg-IaC狀態(tài)的穩(wěn)定性的差異、影響NA療效的因素,對NCR-e+CHB和HBsAg-IaC兩組人群的宿主基本特征及HBV的基因型、PC的G1896A和BCP的A1762T/G1764A變異等病毒學(xué)特征方面進行比較。 2.2研究方法:首先按照2005年《慢性乙型肝炎防治指南》診斷標(biāo)準(zhǔn),收集NCR-e+CHB(治療組)和HBsAg-IaCs(對照組)的血清收集。采用QIAgen bloodDNA檢測試劑盒(Qiagen,德國)分別對117例NCR-e+CHB和58例HBsAg-IaCs進行HBV DNA提取,然后以BS1和POL2為外引物、YS1和YS2為內(nèi)引物行巢式PCR對S區(qū)進行擴增,對HBV DNA S區(qū)擴增陽性的標(biāo)本的PCR產(chǎn)物利用RFLP法進行內(nèi)切酶酶切、電泳、觀察條帶基因分型,基因分型不明確的再進行測序鑒定基因型。再利用巢式PCR對117例NCR-e+CHB和58例HBsAg-IaCs進行PC和BCP區(qū)兩個片段的擴增:以P9、CSP為第一輪引物,再分別以P9、P11和Ce、CSP為第二輪引物,共用第一輪PCR產(chǎn)物進行BCP和PC區(qū)兩個片段的PCR擴增,再利用錯配PCR-RFLP方法對擴增陽性的標(biāo)本的第二輪PCR產(chǎn)物進行酶切確定變異情況,不能酶切的標(biāo)本再行研究一所述的半巢式PCR對CX片段(nt1643-nt1974)進行擴增,對CX片段(nt1643-nt1974)陽性的PCR產(chǎn)物進行直接測序,測序結(jié)果采用Cluster X進行序列排列和人工確認(rèn)以對G1896A和A1762T/G1764A進行檢測。 2.3研究結(jié)果:NCR-e+CHB組男性比例高于HBsAg-IaC組(77.8%vs 58.6%,P=0.008),NCR-e+CHB組的平均年齡大于HBsAg-IaC組(t=2.2.67,P=0.025),NCR-e+CHB組中血清HBV DNA S區(qū)擴增陽性率低于HBsAg-IaC組中血清HBV DNA S區(qū)擴增陽性率(52.1%vs 79.3%,P=0.001),經(jīng)PCR-RFLP和測序的方法分析得出NCR-e+CHB組中1例A型、44例B型、16例C型,HBsAg-IaC組中33例B型、10例C型、2例D型、1例基因型不明,兩組的主要基因型構(gòu)成比無統(tǒng)計學(xué)差異(χ~2=0.154,P=0.694);使用酶切和部分PCR產(chǎn)物直接測序的方法總計得出:NCR-e+CHB組BCP區(qū)A1762T/G1764A檢出率顯著低于HBsAg-IaC組(9.8%vs 41.4%,P=0.002),PC區(qū)G1896A檢出率亦明顯低于HBsAg-IaC組(14.0%vs 72.4%,P=0.000)。 2.4研究結(jié)論:NCR-e+CHB人群的潛在病毒水平較HBsAg-IaC的低。兩組人群中感染的主要HBV基因型構(gòu)成比沒有明顯差異,都是以B基因型為主。NCR-e+CHB患者G1896A和A1762T/G1764A變異檢出率分別低于HBsAg-IaC的以上兩區(qū)域的變異檢出率。
【圖文】：

治療HBeAg陽性慢性乙型肝炎完全應(yīng)答患者的病毒學(xué)特點1.2.5測序結(jié)果利用DNAMAN6.0進行排序，人工判讀，PC和BCP變異圖示如下圖2一1、圖2一2所示}二甲..…，:’，，z.6.0，，，二甲可ild丸1762T/G1764A圖2一1野生株與A1762T/G1764A變異株的對照FigureZ一 1eomParisionbeb刀 eenA1762T/G1764Amutantandwildstrain}…l，二)卿二，…)卿，二，二)卿可i工dG1896A功Utant圖2一2野生株與G18%A變異株的對照FigureZ一 2eomParisionofG1896Amutatantandwildstrain1.2.6質(zhì)量控制方法同第一部分。1:2統(tǒng)計學(xué)分析數(shù)據(jù)使用SPSS13.O統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料用(x士S)表示，兩均數(shù)比較采用兩獨立樣本t檢驗

治療HBeAg陽性慢性乙型肝炎完全應(yīng)答患者的病毒學(xué)特點1.2.5測序結(jié)果利用DNAMAN6.0進行排序，人工判讀，PC和BCP變異圖示如下圖2一1、圖2一2所示}二甲..…，:’，z.6.0，，，二甲可ild丸1762T/G1764A圖2一1野生株與A1762T/G1764A變異株的對照FigureZ一 1eomParisionbeb刀 eenA1762T/G1764Amutantandwildstrain}…l，二)卿二，…)卿，二，二)卿可i工dG1896A功Utant圖2一2野生株與G18%A變異株的對照FigureZ一 2eomParisionofG1896Amutatantandwildstrain1.2.6質(zhì)量控制方法同第一部分。1:2統(tǒng)計學(xué)分析數(shù)據(jù)使用SPSS13.O統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料用(x士S)表示，兩均數(shù)比較采用兩獨立樣本t檢驗
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R512.62

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前8條

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2 周彬;黃月華;單光華;侯金林;王戰(zhàn)會;溫淑娟;;乙肝病毒基因型及病毒變異對慢性肝病進展的影響[J];熱帶醫(yī)學(xué)雜志;2008年04期

3 劉紫錳,陳e

本文編號：2648285