【摘要】：目的探討miR-340對肝星狀細(xì)胞活化、增殖和TGF-β1/Smads信號通路的影響,確定miR-340通過靶定SPP1調(diào)控TGF-β1/Smads信號通路抑制肝星狀細(xì)胞活化和增殖。方法1將20只雄性SD大鼠隨機(jī)分為對照組、模型組,膽總管結(jié)扎手術(shù)制備膽汁淤積性肝纖維化動物模型。2 Agilent mRNA表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)結(jié)果分析,選取具有顯著差異的SPP1作為研究對象。3通過計算機(jī)生物信息學(xué)網(wǎng)站miRanda和Starbase預(yù)測并篩選出miR-340與SPP1之間存在高度保守的互補(bǔ)序列。4 5ng/ml TGF-β1處理LX-2細(xì)胞,q RT-PCR檢測miR-340和SPP1基因mRNA表達(dá)水平的變化。5實時熒光定量PCR和Western blot檢測組織中SPP1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平。6構(gòu)建miR-340過表達(dá)載體pc DNA3/pri-miR-340,將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人肝星狀細(xì)胞系LX-2細(xì)胞,實驗分為轉(zhuǎn)染pc DNA3/pri-miR-340質(zhì)粒組(miR-340組)及轉(zhuǎn)染其對照pc DNA3空載質(zhì)粒組(pc DNA3組)、miR-340 inhibitor組和對照NC inhibitor組四組。7使用雙熒光報告載體實驗驗證miR-340對靶基因的直接調(diào)控作用。8實時熒光定量PCR和Western blot檢測過表達(dá)miR-340或者miR-340功能被抑制后,肝星狀細(xì)胞LX-2中miR-340、SPP1、α-SMA和collagen I mRNA和蛋白以及p-Smad2、p-Smad3蛋白的表達(dá)水平。9 CCK-8實驗檢測miR-340對LX-2細(xì)胞增殖能力的影響。10構(gòu)建pc DNA3/SPP1、sh R-SPP1質(zhì)粒,q RT-PCR和Western blot實驗從mRNA和蛋白水平驗證過表達(dá)或者沉默SPP1對LX-2細(xì)胞中SPP1、p-Smad2、p-Smad3、SPP1、α-SMA和collagen I相對表達(dá)水平的影響。11CCK-8實驗檢測SPP1對LX-2細(xì)胞的增殖能力的影響。結(jié)果1模型組的ALT、AST、TBIL和TBA指標(biāo)均高于對照組,膽汁淤積導(dǎo)致大鼠肝纖維化。2與對照組相比,膽汁淤積性肝纖維化模型組肝組織中的SPP1表達(dá)升高。3 LX-2細(xì)胞經(jīng)過TGF-β1處理后的miR-340 mRNA表達(dá)降低而SPP1 mRNA和蛋白的表達(dá)升高。4雙熒光報告載體實驗證明了miR-340對SPP1的直接調(diào)控作用。5與pc DNA3對照組相比,miR-340在肝星狀細(xì)胞LX-2中過表達(dá)后,miR-340組細(xì)胞中miR-340 mRNA表達(dá)水平升高,而SPP1、α-SMA和collagen I mRNA和蛋白的表達(dá)均降低,p-Smad2、p-Smad3蛋白的表達(dá)也降低;封閉細(xì)胞內(nèi)源性的miR-340功能后,引起相反的結(jié)果。6 CCK-8實驗結(jié)果顯示,過表達(dá)miR-340抑制LX-2細(xì)胞的增殖。7與對照組相比,pc DNA3/SPP1組、p-Smad2、p-Smad3、SPP1、α-SMA和collagen I蛋白的表達(dá)均升高;干擾SPP1后,引起相反的結(jié)果;8 CCK-8實驗結(jié)果顯示,SPP1促進(jìn)LX-2細(xì)胞的增殖。結(jié)論1 miR-340抑制LX-2細(xì)胞活化,細(xì)胞外基質(zhì)沉積和增殖,抑制TGF-β1/Smad信號通路的激活。2 SPP1是miR-340的直接靶基因,miR-340可以負(fù)性調(diào)節(jié)LX-2細(xì)胞中SPP1基因。3 SPP1基因可促進(jìn)LX-2細(xì)胞活化、細(xì)胞外基質(zhì)沉積和增殖,促進(jìn)TGF-β1/Smad信號通路激活。4 miR-340可能通過靶定SPP1來調(diào)節(jié)TGF-β1/Smad信號通路從而抑制肝星狀細(xì)胞活化,從而影響肝纖維化發(fā)生和發(fā)展的過程。圖19幅;表1個;參115篇。
【圖文】：

而且被結(jié)扎的膽總管處突出，如圖 1B。注：A-對照組；B-模型組圖1 大鼠肝臟組織標(biāo)本Fig.1 Rat livers1.3.2 膽汁淤積性肝纖維化大鼠血清生化指標(biāo)實驗分為對照組、模型組。生化指標(biāo)結(jié)果模型組的 ALT、AST、TBIL 和TBA。實驗結(jié)果顯示，大鼠膽汁淤積肝纖維化模型組生化四項指標(biāo)均高于對照組組。大鼠膽汁淤積肝纖維化模型制造成功。表 1 各組大鼠血生化指標(biāo)（n = 3, x ±s）Table 1 The blood biochemical indexes of rats in each group（n=3, x ±s）分組 對照組 模型組ALT μmol/L44.5±1.9 102±2.16AST μ/L132.5±12.9 443.9±22.0TBIL μ/L10.5±0.43 149.5±10.7TBA μmol/L2.57±15.6 217±11.93

注：A-聚類分析熱圖；B-GO 功能分析；C-Pathway 分析圖2 大鼠膽汁淤積性肝纖維化模型mRNA差異表達(dá)芯片分析Fig.2 Analysis of mRNA differentially expressed microarray in rat model of cholestatic hepatic fibrosis1.3.4 與 SPP1 基因具有靶定關(guān)系 miRNA 的篩選生物信息學(xué)網(wǎng)站 Starbase、miRanda 的預(yù)測結(jié)果篩選出 SPP1 為 miR-340 的候選靶基因，，如圖 3。圖3 生物學(xué)預(yù)測SPP1與miR-340靶定關(guān)系Fig.3 Relationship between biological prediction of SPP1 and miR-340 targeting1.3.5 肝臟組織中 SPP1 mRNA 相對表達(dá)水平
【學(xué)位授予單位】：華北理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R575.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2648275