【摘要】： 肝纖維化(hepatic fibrosis, HF)是多種致病因子引起慢性肝病,進(jìn)而發(fā)展為肝硬化的共有病理改變和必經(jīng)途徑,如能阻斷、減輕乃至逆轉(zhuǎn)肝纖維化,就能在很大程度上改善肝病的預(yù)后,因而這一課題也引起了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。 肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells, HSCs)活化、增殖、遷移進(jìn)而合成大量的膠原等細(xì)胞外間質(zhì)(extracellular matrix, ECM)成分是肝纖維化形成的中心環(huán)節(jié)。因此,抑制HSCs活化、遷移、增殖或誘導(dǎo)其凋亡是逆轉(zhuǎn)肝纖維化的關(guān)鍵所在。 細(xì)胞遷移是機(jī)體正常生長(zhǎng)發(fā)育以及組織損傷、修復(fù)和炎癥反應(yīng)必不可缺的病理生理過程,在肝組織損傷及肝纖維化形成過程中,損傷局部大量HSCs聚集可能與HSCs的定向遷移有關(guān),在此過程中又受到一系列復(fù)雜的細(xì)胞因子的網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)。 黏著斑激酶(focal adhesion kinase, FAK)是整合素信號(hào)通路的關(guān)鍵信號(hào)分子,多項(xiàng)研究表明其在成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及多種腫瘤細(xì)胞的黏附、遷移中發(fā)揮關(guān)鍵作用,但對(duì)HSCs黏附、遷移的影響知之甚少。RNA干擾(RNA interference, RNAi)是目前最有效的基因沉默技術(shù),能特異性抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄,進(jìn)而下調(diào)相應(yīng)蛋白水平及功能。 為此,我們采用RNAi技術(shù),從HSCs遷移入手,以FAK為切入點(diǎn),構(gòu)建了靶向FAK的RNAi序列,在陽(yáng)離子聚合物介導(dǎo)下將干擾質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HSCs,研究特異性阻斷FAK表達(dá)對(duì)纖維連接蛋白(fibronectin, FN)刺激的HSCs黏附、遷移的影響及其機(jī)制。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容包括以下兩部分: 第一部分:靶向FAK特異性RNA干擾重組體的構(gòu)建及篩選目的:利用pEGFP質(zhì)粒構(gòu)建靶向FAK的短發(fā)卡 RNA(shRNA)干擾重組體,并通過轉(zhuǎn)染HSCs篩選有效的干擾序列。 方法:利用在線設(shè)計(jì)軟件,分別設(shè)計(jì)兩對(duì)針對(duì)FAK的有小發(fā)卡結(jié)構(gòu)的兩條DNA序列及一對(duì)非特異對(duì)照序列,經(jīng)退火成互補(bǔ)雙鏈,再克隆至帶有U6啟動(dòng)子及增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)的質(zhì)粒pEGFP中,構(gòu)建重組體,轉(zhuǎn)化大腸桿菌(DH5α)菌株,提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定后,進(jìn)行測(cè)序分析。體外培養(yǎng)HSCs,并以FN刺激HSCs增殖,在陽(yáng)離子聚合物梭華-SofastTM介導(dǎo)下,將構(gòu)建成功的3組重組體轉(zhuǎn)染大鼠肝星狀細(xì)胞系HSC-T6。采用熒光顯微鏡及流式細(xì)胞儀分析轉(zhuǎn)染效果;通過real-time Q-PCR技術(shù)檢測(cè)各組FAK mRNA變化,Western blot技術(shù)檢測(cè)FAK蛋白表達(dá)情況,篩選出有效抑制FAK表達(dá)的序列。實(shí)驗(yàn)分6組:①空白對(duì)照組(簡(jiǎn)寫為Con);②FN刺激組(簡(jiǎn)寫為FN組);③轉(zhuǎn)染試劑組(簡(jiǎn)寫為Sofast組);④pEGFP-HK shRNA組(簡(jiǎn)寫為HK組);⑤pEGFP-FAK shRNA1組(簡(jiǎn)寫為shRNA1組);⑥pEGFP-FAK shRNA2組(簡(jiǎn)寫為shRNA2組)。②～⑥組中FN濃度均為10μg·mL-1。 結(jié)果:①酶切測(cè)序分析結(jié)果表明已成功構(gòu)建了能表達(dá)FAK shRNA的兩組重組體pEGFP-FAK shRNA及通用陰性對(duì)照pEGFP-HK shRNA;②轉(zhuǎn)染后48 h,利用熒光顯微鏡及流式細(xì)胞儀證實(shí)轉(zhuǎn)染成功,轉(zhuǎn)染效率約40%;③shRNA下調(diào)FAK mRNA的表達(dá):real-time Q-PCR結(jié)果顯示,FN組,Sofast組及HK組之間無(wú)明顯差異,shRNA1組和shRNA2組mRNA均有降低,其中shRNA1組下調(diào)率為52.98%,shRNA2下調(diào)率為76.82%;④shRNA抑制FAK蛋白表達(dá):Western blot分析,在125 kD位置出現(xiàn)FAK雜交帶,光密度值結(jié)果顯示,shRNA可顯著下調(diào)FAK蛋白的表達(dá),shRNA1轉(zhuǎn)染后48 h蛋白下調(diào)率為51.50%,shRNA2轉(zhuǎn)染后48 h蛋白下調(diào)率為72.53%,故選取shRNA2進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。 結(jié)論:利用含U6啟動(dòng)子及EGFP的質(zhì)粒載體pEGFP可成功構(gòu)建FAK的shRNA干擾重組體,且可成功轉(zhuǎn)染入HSCs,其中shRNA2對(duì)FAK的抑制效率較高。 第二部分:FAK shRNA干擾重組體抑制肝星狀細(xì)胞黏附與遷移及其機(jī)制 目的:應(yīng)用FAK shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HSCs,探討特異性阻斷FAK表達(dá)對(duì)FN介導(dǎo)的HSCs黏附和遷移的影響。方法:應(yīng)用體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù),采用甲苯胺藍(lán)染色法了解shRNA對(duì)HSCs黏附的抑制情況;采用傷口愈合實(shí)驗(yàn)以及改良的Boyden雙腔系統(tǒng)了解FAK shRNA對(duì)HSCs平面遷移和跨膜遷移的抑制作用;采用real-time Q-PCR技術(shù)檢測(cè)FAK、ERK1 mRNA水平變化,Western blot技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后FAK、p-FAK、ERK1及p-ERK蛋白表達(dá)情況。 結(jié)果:①FAK shRNA抑制FAK mRNA表達(dá):real-time Q-PCR結(jié)果顯示shRNA可顯著下調(diào)FAK mRNA的表達(dá),且對(duì)FAK mRNA的下調(diào)從干擾后12 h即出現(xiàn),最高下調(diào)率出現(xiàn)在干擾后24 h,為70.51%,但瞬時(shí)轉(zhuǎn)染對(duì)FAK mRNA的下調(diào)持續(xù)時(shí)間較短,48 h后mRNA水平有所回升;②FAK shRNA抑制FAK表達(dá)及活化:Western blot結(jié)果顯示,shRNA可顯著下調(diào)FAK蛋白的表達(dá),但出現(xiàn)蛋白下調(diào)的時(shí)間晚于mRNA,干擾后24 h FAK蛋白表達(dá)開始下調(diào),最高下調(diào)率出現(xiàn)在干擾后48 h,為71.81%,干擾后72 h蛋白表達(dá)有所回升;p-FAK(Tyr397)蛋白表達(dá)亦表現(xiàn)出同樣的變化:FN組中p-FAK蛋白含量較對(duì)照組升高37.89%;但FN組、Sofast組與HK組之間比較無(wú)明顯差異;shRNA轉(zhuǎn)染48 h后,p-FAK(Tyr397)蛋白表達(dá)較HK組顯著降低,下調(diào)率為62.71%,經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理有顯著性差異,說明FAK shRNA干預(yù)HSCs可明顯抑制FAK磷酸化;③FAK shRNA抑制ERK1表達(dá)及活化:real-time Q-PCR結(jié)果顯示,干擾后24 h,FN組ERK1 mRNA表達(dá)較對(duì)照組增強(qiáng)70.27%,而FN組、Sofast組與HK組之間無(wú)明顯差異;FAK shRNA干擾組ERK1 mRNA表達(dá)較HK組明顯下降,最高下調(diào)率為55.67%,出現(xiàn)在干擾后48 h。Western blot顯示FN刺激后HSCs ERK1蛋白表達(dá)量較對(duì)照組上調(diào)77.55%,但與Sofast組、HK組比較無(wú)明顯差異,FAK shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HSCs 48 h后,ERK1蛋白表達(dá)量顯著降低,較HK組下降了65.13%。同時(shí),p-ERK的變化也表現(xiàn)出相似的趨勢(shì),其最高下調(diào)率為75.47%,出現(xiàn)在干擾后72 h。④FAK shRNA抑制HSCs黏附:根據(jù)以上結(jié)果,選取蛋白下調(diào)率最高的時(shí)間點(diǎn),即干擾后48 h進(jìn)行HSCs黏附和遷移的檢測(cè)。應(yīng)用FN包被培養(yǎng)板,與Con組相比,FN組HSCs黏附率增加了35.68%,FN組、Sofast組、HK組之間無(wú)明顯差異,FAK shRNA轉(zhuǎn)染48 h后,細(xì)胞黏附率較HK組降低58.69%,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。⑤FAK抑制HSCs遷移:傷口愈合實(shí)驗(yàn)表明,FN刺激后,細(xì)胞遷移距離較Con組增加63.00%,FN組、Sofast組、HK組之間無(wú)明顯差異,shRNA組細(xì)胞遷移距離較HK組減低58.27%,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。細(xì)胞跨膜遷移結(jié)果分析顯示:FN組細(xì)胞遷移數(shù)較對(duì)照組增加82.25%,差異有顯著性,FN組、Sofast組、HK組之間無(wú)明顯差異,FAK shRNA轉(zhuǎn)染組跨膜細(xì)胞數(shù)較HK組顯著下降,其抑制率為83.70%。說明FAK shRNA可抑制HSCs的平面和跨膜遷移能力。 結(jié)論:FN可有效誘導(dǎo)HSCs的黏附和遷移,并刺激FAK、ERK1的表達(dá)和活化,在陽(yáng)離子聚合物介導(dǎo)下瞬時(shí)轉(zhuǎn)染靶向FAK的shRNA質(zhì)粒,可在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平下調(diào)FAK表達(dá),伴隨FAK活性的下降,ERK1的表達(dá)亦表現(xiàn)出相似的變化,同時(shí)HSCs的黏附和遷移能力明顯受到抑制。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R575.2

【參考文獻(xiàn)】

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2 姜慧卿,張曉嵐,王占魁,劉麗,鄭毅林,姚希賢;大鼠肝纖維化過程中肝組織黏著斑激酶表達(dá)增加[J];基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床;2005年01期

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本文編號(hào)：2645849