【摘要】： 目的 建立大鼠肝缺血再灌注損傷模型,按時(shí)點(diǎn)采集標(biāo)本,對(duì)血清尿素氮(BUN),血清肌酐(Cr),腎組織脂質(zhì)過(guò)氧化物的終產(chǎn)物-丙二醛(MDA)及血清中腫瘤壞死因子(TNF-a)進(jìn)行測(cè)定；對(duì)腎組織進(jìn)行MMP-2、MMP-9蛋白測(cè)定,探討氯化釓抑制枯否細(xì)胞對(duì)大鼠肝缺血再灌注所致腎損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制。 材料與方法 1、材料 選擇周齡為7～8周雄性Wistar大鼠100只,體重為180～220g,按體重隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組(氯化釓+肝缺血再灌注)和對(duì)照組(生理鹽水+肝缺血再灌注)。氯化釓購(gòu)自日本和光純藥工業(yè)株式會(huì)社；血生化相關(guān)試劑購(gòu)自德國(guó)寶靈曼公司；TNF-a試劑盒(美國(guó)BD公司)；丙二醛(MDA)測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所)；兔抗大鼠MMP-9抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)；兔抗大鼠MMP-2抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)。HITACHI-7600A全自動(dòng)生化分析儀；芬蘭Multlskan MK-3型全自動(dòng)多功能型酶標(biāo)儀；圖片分析采用MetaMorph/Evolution MP5.0/BX51顯微圖象分析系統(tǒng)。 2、方法 實(shí)驗(yàn)組術(shù)前24h、48h經(jīng)鼠尾靜脈注射氯化釓(1Omg/kg),對(duì)照組給予等量生理鹽水。參照Kobayashi法建立左半肝缺血再灌注模型(阻斷左肝動(dòng)脈、門(mén)靜脈及肝管),缺血均為60分鐘,按再灌注后0.5h, 1h、6h、12h、24h時(shí)點(diǎn)采集標(biāo)本,每組每個(gè)時(shí)點(diǎn)10只大鼠。麻醉藥選擇10%水合氯醛,按3ml/kg計(jì)量腹腔注射給藥。免疫組化標(biāo)本固定均采用4%多聚甲醛0.1mol/L磷酸緩沖液(pH=7.3)。經(jīng)膈肌心臟穿刺取血后,離心5min,留取上清液,血清由超低溫冰箱保存,集中測(cè)定。采用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定血清中TNF-a的水平。取大鼠左腎,其中左腎中1／3腎組織均漿后TBA法測(cè)定MDA；取左腎下1／3腎組織2×1x0.3cm行免疫組化染色。免疫組化結(jié)果在400倍光鏡下觀察,胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色為陽(yáng)性細(xì)胞。每張切片取5個(gè)不重疊的高倍視野,測(cè)量IOD值,求出其均值,代表本張切片的平均IOD值。IOD為累計(jì)積分光密度。所有計(jì)量指標(biāo)均用mean士SD表示。所有數(shù)據(jù)均用專業(yè)軟件SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì),采用t檢驗(yàn)。 結(jié)果 1、血清BUN 再灌注后1h開(kāi)始,實(shí)驗(yàn)組血清BUN低于對(duì)照組,且6、12及24h時(shí)點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比有顯著性差異(P0.05)。 2、血清Cr 再灌注后,各時(shí)點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組血清Cr均低于對(duì)照組,實(shí)驗(yàn)組在再灌注后6、12及24h時(shí)點(diǎn)與對(duì)照組相比有顯著性差異(P0.05)。 3、血清TNF-α 再灌注后,實(shí)驗(yàn)組各時(shí)點(diǎn)的血清TNF-α均低于對(duì)照組,有顯著差異(P0.05)。且兩組走勢(shì)基本相同,12h達(dá)到高峰,之后有下降趨勢(shì)。 4、腎組織勻漿MDA 再灌注后6h、12h、24h時(shí)點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組MDA明顯低于對(duì)照組(P0.05)。 5、腎組織MMP-2染色 再灌注后,兩組染色的IOD值均隨時(shí)間延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì),12h后上升趨勢(shì)變緩。實(shí)驗(yàn)組再灌注后各時(shí)點(diǎn)IOD值均低于對(duì)照組,且6、12及24h時(shí)點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組之間存在顯著性差異(P0.05)。陽(yáng)性表達(dá)部位主要在皮質(zhì)深層近曲小管上皮細(xì)胞、腎小管周圍的血管內(nèi)皮細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞。 6、腎組織MMP-9染色 再灌注后,兩組IOD值隨時(shí)間呈遞增走勢(shì),實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組增長(zhǎng)速度緩慢,各時(shí)點(diǎn)IOD值均低于對(duì)照組,且6、12及24h時(shí)點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組之間存在顯著性差異(P0.05)。陽(yáng)性表達(dá)部位與MMP-2陽(yáng)性表達(dá)部位相近,主要在皮質(zhì)深層近曲小管上皮細(xì)胞、腎小管周圍的血管內(nèi)皮細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞。 結(jié)論 本研究通過(guò)建立大鼠肝缺血再灌注損傷模型,按再灌注后不同時(shí)點(diǎn)分別采集標(biāo)本,測(cè)定血清BUN、血清Cr、血清TNF-α、腎組織MDA以及對(duì)腎組織行MMP-2、MMP-9免疫組化染色,探討氯化釓抑制枯否細(xì)胞對(duì)大鼠肝缺血再灌注所致腎損傷的影響,得出以下結(jié)論：①在肝缺血再灌注過(guò)程中,枯否細(xì)胞被激活并釋放的大量生物活性物質(zhì),隨體循環(huán)到達(dá)腎時(shí),造成的腎損傷；②生物活性物質(zhì),如TNF-α、氧自由基等可對(duì)腎臟造成直接傷害外,還可以通過(guò)上調(diào)腎組織中MMP-2、MMP-9的表達(dá),加重腎臟的損傷；③抑制枯否細(xì)胞的激活,減少氧自由基的釋放及血液中TNF-α的濃度,避免腎組織中MMP-2、MMP-9的表達(dá)上調(diào),從而減輕腎臟的損傷。
【圖文】：

1、血清BUN再灌注后lh開(kāi)始，實(shí)驗(yàn)組血清BUN低于對(duì)照組，且6、12及24h時(shí)點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比有顯著性差異(P<0.05)(表1，圖1)。表1，缺血再灌注大鼠血清Bt」N分組0.5h(mean士SD，mmo比) 12h24h實(shí)驗(yàn)組對(duì)照組6.77士1.746.7壯2.097名肚2.41 8.4肚2.028.27士2.31.10.65士2.63 11.9肚2.6215.75理.6314.41土2.2818.8肚4.29*P<0乃5，實(shí)驗(yàn)組vs對(duì)照組丁丁 丁 山山:..........................實(shí)驗(yàn)組 組...對(duì)照組 組圖1，缺血再灌注大鼠血清BUN2、血清Cr再灌注后，各時(shí)點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組血清Cr均低于對(duì)照組，24h時(shí)點(diǎn)與對(duì)照組相比有顯著性差異(P<0.05)(表2，表2

衣戲‘，，、愁.廠、里、圖10，、.誼協(xié);介、氣.氣心丹二‘味.‘l再灌注24h，MMP一9免疫組化染色，孫貧一r份“‘二認(rèn)‘·‘:t"A為實(shí)驗(yàn)組，B為對(duì)照組(x4OO)、，倉(cāng)小.診.。.;口..，尸.討論一般認(rèn)為血清尿素氮(BUN)及血清肌配(Cr)是評(píng)價(jià)腎臟功能的重要指標(biāo)，血清肌配敏感性較血清尿素氮高。表1顯示
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R575

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2641800