【摘要】： 目的 腸屏障損傷導(dǎo)致內(nèi)毒素入血是梗阻性黃疸時腎功能損害的重要的病理生理機(jī)制之一。既往本課題組通過研究大鼠梗阻性黃疸動物實驗時發(fā)現(xiàn),梗阻性黃疸時,腎集合管上皮細(xì)胞中AQP2的表達(dá)顯著降低。本實驗擬在細(xì)胞水平上明確內(nèi)毒素對大鼠腎髓質(zhì)上皮細(xì)胞的影響,以及水通道蛋白2表達(dá)的變化。 方法 培養(yǎng)并傳代大鼠腎髓質(zhì)上皮細(xì)胞系mIMCD-3,選取處于指數(shù)生長期的細(xì)胞制作細(xì)胞爬片,免疫組化DAB染色法檢測水通道蛋白2在大鼠腎髓質(zhì)上皮細(xì)胞mIMCD-3的表達(dá)及定位。分別用終濃度為0.1,0.5,1,5,10μg/L的內(nèi)毒素與大鼠腎髓質(zhì)上皮細(xì)胞mIMCD-3培養(yǎng)12h,24h,48h,72h后用CCK-8檢測吸光度,計算細(xì)胞抑制率。選取作用明顯的終濃度為10μg/L的內(nèi)毒素作用于mlMCD-3后分別在4h,12h,24h,48h用流式細(xì)胞儀檢測凋亡。用同一濃度的內(nèi)毒素培養(yǎng)mlMCD-3在4h,24h后用免疫組化DAB染色法檢測水通道蛋白2的表達(dá)情況,并做光密度分析。所有計數(shù)資料均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差形式表示,運用統(tǒng)計軟件SPSS13.0進(jìn)行單因素的方差分析,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果 mIMCD-3表達(dá)AQP2。培養(yǎng)并制作細(xì)胞爬片后,用免疫組化和DAB染色可見,細(xì)胞胞漿中大量棕紅色顆粒,呈片或呈堆積狀排列,證明mIMCD-3表達(dá)AQP2,并且在基礎(chǔ)狀態(tài)下的AQP2主要定位于細(xì)胞漿中。同時行陰性對照的細(xì)胞做免疫組化時,沒有添加特異性結(jié)合的一抗,用DAB染色后胞漿中無棕紅色顆粒生成,整個胞漿為蘇木素淡染的藍(lán)色,排除了AQP2表達(dá)的假陽性的存在。 LPS抑制腎髓質(zhì)上皮細(xì)胞mIMCD-3增殖。不同濃度分別做單因素方差分析,具有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。做組間兩兩分析時,12小時0.5μg/L和1μg/L,5μg/L和10μg/L;24小時0.5μg/L和1μg/L;72小時0.1μg/L和0.5μg/L,0.5μg/L和1μg/L,1μg/L和5μg/L,5μg/L和10μg/L比較,不具有統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。證明濃度低于5μg/L時,LPS的濃度變化對細(xì)胞增殖的抑制作用差別不大,增大濃度梯度時,LPS對細(xì)胞的抑制作用明顯增強(qiáng),具有濃度依賴性。濃度為0.1μg/L的LPS在對細(xì)胞作用的早期,對細(xì)胞不僅沒有抑制,反而有增殖的作用。當(dāng)作用時間增加到72小時時,相鄰濃度組間的比較不具有統(tǒng)計學(xué)差異,各組間細(xì)胞的抑制率無差別。不同時間組分別行單因素方差比較,具有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。但0.1μg/L組12小時和24小時,0.5μg/L組12小時和24小時,24小時和48小時比較,1μg/L組12小時和24小時比較,不具有統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。證明濃度低于1μg/L時,細(xì)胞的抑制率隨時間變化不大。濃度大于等于5μg/L時,任意兩兩組間對比均具有統(tǒng)計學(xué)差異。LPS對mIMCD-3的抑制作用具有時間依賴性。 LPS誘導(dǎo)腎髓質(zhì)上皮細(xì)胞mIMCD-3凋亡。將終濃度為10μg/L的LPS溶液作用于腎髓質(zhì)上皮細(xì)胞mIMCD-3 0h,4h,24h和48h后,經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測,結(jié)果表明,LPS對mIMCD-3的抑制作用主要表現(xiàn)為細(xì)胞凋亡,隨作用時間的延長,細(xì)胞凋亡增加(P＜0.01),同時作用時間和凋亡率具有直線相關(guān)性(R=0.9920)。 對腎髓質(zhì)上皮細(xì)胞mIMCD-3行組化染色可以看出,AQP2的表達(dá)主要位于細(xì)胞質(zhì),表現(xiàn)為棕黃粗大的顆粒成片或成堆排列。LPS作用于mIMCD-3后,AQP的表達(dá)下調(diào),細(xì)胞中棕黃色顆粒變稀疏,且顏色變淺。濃度為10μg/L的LPS作用細(xì)胞0小時,4小時和24小時的平均光密度分析,總體比較具有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.01)。但組間作用時間4小時和0小時比較,不具有統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.897),24小時組和4小時組比較,24組和0小時組比較,明顯具有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.01)。證明在短時間內(nèi),時間小于4小時,LPS對AQP2表達(dá)的變化沒有影響,但隨LPS作用時間的延長,AQP2的表達(dá)下降。 結(jié)論 mIMCD-3表達(dá)AQP2,基礎(chǔ)狀態(tài)下的AQP2主要定位于細(xì)胞漿中。LPS抑制mIMCD-3增殖,具有時間依賴性和劑量依賴性。LPS對細(xì)胞增殖的抑制作用主要表現(xiàn)為誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。隨作用時間延長,細(xì)胞凋亡率增加,兩者具有直線相關(guān)。LPS介導(dǎo)的腎髓質(zhì)上皮細(xì)胞凋亡通路中,AQP2起重要作用。
【圖文】：

、.AQPZ在腎髓質(zhì)上皮細(xì)胞中的表達(dá)，陽性對照圖(S一P法x4紅色的顆粒即為AQPZ的表達(dá)。細(xì)胞胞漿中大量棕紅色顆列，證明mIMCD一3表達(dá)AQPZ，并且在基礎(chǔ)狀態(tài)下的AQP中。

.AQPZ在腎髓質(zhì)上皮細(xì)胞中的表達(dá)，陰性對照圖(S一P法x400素淡染的藍(lán)色，無棕紅色顆粒。行陰性對照的細(xì)胞做免疫組化性結(jié)合的一抗，用DAB染色后胞漿中無棕紅色顆粒生成，，排除陽性的存在。
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R575;R692

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本文編號：2641269