【摘要】： 乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)屬于嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviradae),具有獨(dú)特的基因組結(jié)構(gòu)及生物學(xué)特性。由HBV感染引起的乙型肝炎是嚴(yán)重危害人類健康的疾病。目前,臨床上針對HBV感染的抗病毒藥物主要為核苷類似物和干擾素-α(Interferon-α, IFN-α)。IFN-α的抗HBV的機(jī)制以及相關(guān)的干擾素刺激基因(IFN-stimulated genes, IS Gs)的生物學(xué)功能尚未完全闡明。我們和其他實(shí)驗(yàn)室以前的研究結(jié)果顯示,髓樣細(xì)胞分化蛋白88(Myeloid differentiation primary response protein 88, MyD88)的表達(dá)能被干擾素誘導(dǎo),并且在肝腫瘤細(xì)胞中能通過激活NF-κB抑制HBV的復(fù)制。與此同時(shí),HBV編碼的聚合酶蛋白通過抑制stat1的入核下調(diào)MyD88啟動(dòng)子活性從而抑制干擾素誘導(dǎo)的MyD88的表達(dá)。這些結(jié)果提示,MyD88可能在干擾素抑制HBV復(fù)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用。但是MyD88的抗病毒機(jī)制仍不甚明了,有必要進(jìn)一步研究其詳細(xì)的作用機(jī)制。 為了進(jìn)一步驗(yàn)證MyD88的抗病毒作用,首先用MyD88重組腺病毒(Ad-MyD88)感染有穩(wěn)定HBV復(fù)制的HepG2.2.15細(xì)胞,然后用Northern-blot和Southern-blot檢測病毒RNA和病毒核心顆粒相關(guān)DNA水平。結(jié)果顯示,與對照相比,Ad-MyD88感染同等程度地降低了病毒RNA和核心顆粒相關(guān)DNA的水平,提示MyD88抗病毒作用的一級靶位點(diǎn)可能是病毒RNA,這一點(diǎn)隨后用只能進(jìn)行病毒RNA的轉(zhuǎn)錄而不能進(jìn)行病毒基因組復(fù)制的pCIdA-HBV所證實(shí)。此外在通過小鼠尾靜脈高壓注射HBV復(fù)制質(zhì)粒建立的急性感染模型中,MyD88也具有與在體外相似的抗病毒作用。 為了探討是否MyD88在生理?xiàng)l件下也能發(fā)揮抗病毒作用,將MyD88 siRNA轉(zhuǎn)入Huh7細(xì)胞,然后測定IFN-α的抗病毒活性。結(jié)果顯示,在MyD88 knock-down細(xì)胞中,HBV對IFN-α的抗病毒作用有了一定的抵抗能力,提示MyD88在IFN-α抑制HBV復(fù)制中發(fā)揮一定作用。 MyD88能直接下調(diào)病毒RNA水平,這可能發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平,也可能發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平。結(jié)果顯示,MyD88對由HBV啟動(dòng)子和增強(qiáng)子調(diào)控的熒光素酶的活性沒有顯著影響,但是能抑制受CMV啟動(dòng)子啟動(dòng)的pregenomic RNA的水平。這些結(jié)果提示,MyD88下調(diào)病毒RNA水平是一轉(zhuǎn)錄后水平事件。 為了進(jìn)一步研究MyD88轉(zhuǎn)錄后下調(diào)pregenomic RNA的機(jī)制,利用Tet-off系統(tǒng)研究MyD88對pregenomic RNA穩(wěn)定性的影響。結(jié)果顯示MyD88可以降低pregenomic RNA的穩(wěn)定性。進(jìn)一步通過核漿分離顯示,MyD88降低了pregenomicRNA在胞漿中的穩(wěn)定性,但是對胞核中pregenomic RNA的穩(wěn)定性沒有影響。RNA干擾實(shí)驗(yàn)表明,MyD88對pregenomic RNA在胞漿中的降解是通過細(xì)胞中的兩條mRNA降解通路即5'-3'mRNA降解通路和3'-5'mRNA降解通路進(jìn)行。 細(xì)胞蛋白La可與HBV pregenomic RNA特異結(jié)合促進(jìn)pregenomic RNA的穩(wěn)定性。但是本研究顯示,MyD88誘導(dǎo)pregenomic RNA的降解不依賴于La蛋白與pregenomic RNA的相互作用。進(jìn)一步通過mapping分析發(fā)現(xiàn)HBV(1804-2454)和HBV(1151-1684)是MyD88的應(yīng)答序列。隨后以pregenomic RNA為背景,構(gòu)建HBV(1804-2454)和HBV(1151-1684)的缺失突變體,然后測定它們對MyD88的敏感性。結(jié)果顯示,HBV(1151-1684)的缺失突變體仍然保留著對MyD88的應(yīng)答能力,而HBV(1804-2454)的缺失突變體喪失了對MyD88的敏感性,表明位于HBV pregenomic RNA 5'末端的HBV(1804-2454)序列為MyD88誘導(dǎo)pegenomic RNA降解的一個(gè)關(guān)鍵的順式作用序列。 RNA序列HBV(1151-1684)位于HBV pregenomic RNA和preS/S RNAs的重疊區(qū)域,因此它可能選擇性賦予了preS/S RNAs對MyD88的敏感性。結(jié)果顯示,RNA序列HBV(1151-1684)選擇性介導(dǎo)了HBV preS/S RNA的降解,并且這種降解主要發(fā)生在核內(nèi)。 有趣的是RNA序列HBV(1151-1684)與HBV轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件(posttranscriptional regulatory element, PRE)完全重疊。HBVPRE選擇性介導(dǎo)preS2/S RNAs出核,不能出核的RNA最后以一種未知的機(jī)制在核中降解。因此MyD88導(dǎo)致preS/S RNAs在核中降解可能是由于MyD88干擾了PRE介導(dǎo)的preS/S RNAs出核所導(dǎo)致。通過CAT活性分析顯示,MyD88可以降低PRE介導(dǎo)的CAT活性,并且不是由于MyD88直接導(dǎo)致其在核中降解所造成,因?yàn)樵赑RE出核抑制蛋白NES(-)RanBP1共表達(dá)的條件下,MyD88不能進(jìn)一步抑制CAT的活性,而PRE的核輸出因子多嘧啶莖結(jié)合蛋白(polypyrimidne tract-binding protein, PTB)的表達(dá)幾乎完全恢復(fù)了PRE促進(jìn)出核的功能。隨后通過核漿分離用Northern-blot證實(shí)了CAT活性分析的結(jié)果。因此,從以上結(jié)果可以得出MyD88抑制了PRE介導(dǎo)的preS2/S RNAs出核。 為了進(jìn)一步研究MyD88抑制PRE介導(dǎo)的preS/S RNAs出核機(jī)制,檢測了PTB的表達(dá)水平。結(jié)果顯示MyD88可以同等程度地下調(diào)PRE核輸出因子PTB的蛋白水平和mRNA水平,提示MyD88對PTB表達(dá)的抑制發(fā)生在PTB mRNA水平。進(jìn)一步檢測MyD88對PTB mRNA穩(wěn)定性的影響發(fā)現(xiàn),MyD88對PTBmRNA穩(wěn)定性沒有明顯影響,提示MyD88對PTB表達(dá)水平的抑制是一轉(zhuǎn)錄水平事件。 總之,本研究進(jìn)一步探討了MyD88的抗病毒作用和機(jī)制,對該機(jī)制的闡明將有助于新的治療乙型肝炎的藥物的開發(fā)。
【圖文】：

MyD88是固有免疫(Ilmatei~ity)應(yīng)答級聯(lián)通路中的一個(gè)接頭分子(AdaPtor)(25)。我們和其他實(shí)驗(yàn)室以前的研究結(jié)果顯示，MyD88表達(dá)能被干擾素誘導(dǎo)，并且在肝腫瘤細(xì)胞中能通過激活N’F一忍抑制HBV的復(fù)制(15，51，52)。與此同時(shí)，HBv編碼的聚合酶蛋白Poly’rnerase通過抑制statl的入核下調(diào)MyD88啟動(dòng)子活性從而抑制干擾素誘導(dǎo)的MyD88的表達(dá)(50)。這些結(jié)果提示，MyD88可能在干擾素抑制HBV復(fù)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用。本研究的目的是想進(jìn)一步在體內(nèi)和體外研究MyD88的抗病毒作用及其機(jī)制，為開發(fā)新的抗HBv藥物提供理論根據(jù)和奠定基礎(chǔ)。我們發(fā)現(xiàn)MyD88能在HePG2.2.巧細(xì)胞和Balb/。小鼠中抑制HBV復(fù)制，并且主要是通過下調(diào)病毒RNA水平;進(jìn)一步研究顯示，MyD88是在轉(zhuǎn)錄后水平下調(diào)病毒RNA水平;MyD88降低病毒pregenomicRNA的穩(wěn)定性，并且是通過作用于pregenomicRNA的5’末端區(qū);與此同時(shí)，M必88抑制HBV轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件(posttranscriPtiona

博士學(xué)位論文結(jié)果圖2一2過表達(dá)MyD88直接下調(diào)病毒RNA水平pCIdA一HBV不 11pCMV胭ye或者pCMV徹ye一MyD88分別共轉(zhuǎn)入Huh7和HepGZ細(xì)胞，48小時(shí)后，Northem一blot檢測病毒RNA水平，檢測完病毒RNA后，剝離結(jié)合的探針，，檢測GAPDH水平，作為上樣內(nèi)參。二、干擾MyD88的表達(dá)水平削弱了IFN-a的抗病毒作用以上結(jié)果和以前的結(jié)果(巧，28，51)表明
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R512.62

【共引文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 翟欽輝;董曉芳;佟建明;鮑延娥;;膽堿生物利用率的評價(jià)及其在蛋雞養(yǎng)殖中的應(yīng)用[J];動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)報(bào);2012年09期

2 陳敏;李怡芳;何蓉蓉;栗原博;;干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白抗甲型流感病毒的研究進(jìn)展[J];國際藥學(xué)研究雜志;2013年06期

3 吳燕婉;劉德瑜;;溶酶體的細(xì)胞死亡通路[J];解剖學(xué)報(bào);2007年04期

4 張雯;崔越宏;劉天舒;;自噬在低氧誘導(dǎo)的抗腫瘤耐藥中的研究進(jìn)展[J];臨床腫瘤學(xué)雜志;2013年11期

5 Kadija Abounit;Tiziano M Scarabelli;Roy B McCauley;;Autophagy in mammalian cells[J];World Journal of Biological Chemistry;2012年01期

6 趙振東;曾慶江;陳麗娜;宋泉聲;陳英玉;;重組自噬標(biāo)志分子LC3的抗血清制備[J];中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào);2007年06期

7 周廣舟;張璐;盧延克;司燦;徐蘇麗;;魚類細(xì)胞自噬研究進(jìn)展[J];生物技術(shù)通報(bào);2012年04期

8 陳季武;王幫正;高秀霞;張園園;;自噬系統(tǒng)和蛋白酶體系統(tǒng)之間的相互聯(lián)系[J];生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展;2013年03期

9 李寶華;熊思東;;自噬對胞內(nèi)感染病原體的雙重作用[J];微生物與感染;2006年03期

10 胡晚秋;林志祥;陳麗蓮;晏向華;陳放;;HOPS復(fù)合體蛋白在細(xì)胞自噬過程中的功能研究[J];中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào);2011年08期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 馬芹穎;快速老化小鼠SAMP8老化過程中自噬的改變以及mTOR信號通路功能研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2011年

2 王曉星;免疫調(diào)節(jié)劑在小鼠動(dòng)脈粥樣硬化及肺纖維化中的應(yīng)用[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2011年

3 張幸鼎;DRAM1通過溶酶體調(diào)節(jié)自噬和細(xì)胞凋亡[D];蘇州大學(xué);2011年

4 段振玲;上皮性卵巢癌中自噬基因Beclin1的表達(dá)及其調(diào)控相關(guān)信號途徑PI3K/PKB的實(shí)驗(yàn)研究[D];四川大學(xué);2007年

5 曾梅;自我吞噬及mTOR信號在小鼠神經(jīng)瘤細(xì)胞分化過程中的作用[D];中國科學(xué)技術(shù)大學(xué);2008年

6 于春艷;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激—自噬反應(yīng)在維生素K3誘導(dǎo)人宮頸癌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷中的作用[D];吉林大學(xué);2010年

7 楊聚榮;miR-34通過自噬作用調(diào)控衰老的機(jī)制研究[D];中國人民解放軍軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院;2010年

8 劉虹;白介素-17A抑制GSK3β介導(dǎo)的細(xì)胞自噬調(diào)節(jié)機(jī)制及其在肺纖維化中的應(yīng)用[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2013年

9 馬永剛;阻斷Toll樣受體-2活性改善阿霉素及缺血誘導(dǎo)的心功能障礙及心肌重塑[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2010年

10 鮑華燕;阻斷胞外HSP70活性改善阿霉素誘導(dǎo)的小鼠心功能障礙和心肌重構(gòu)[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2012年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 吳婧嬌;LRG-47對日本血吸蟲感染抗性調(diào)節(jié)的研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2010年

2 關(guān)慧;酒精性肝病中蛋白酶體活性抑制與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激間相關(guān)性的體外實(shí)驗(yàn)研究[D];山東大學(xué);2011年

3 國艷春;褪黑素通過增強(qiáng)自噬保護(hù)缺血再灌注損傷的N2a[D];華中科技大學(xué);2009年

4 趙柯;IFN-α對人初始CD4~+T淋巴細(xì)胞中抗病毒因子APOBEC3F表達(dá)影響及其機(jī)制的初步研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2011年

5 王亮;Necrostatin-1在大鼠心肌缺血/再灌注損傷中的延遲性心肌保護(hù)作用[D];山西醫(yī)科大學(xué);2008年

6 婁琨;BAM長循環(huán)熱敏脂質(zhì)體的制備及其腦靶向作用初步研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2009年

7 姜?jiǎng)P;環(huán)孢素A下調(diào)腫瘤特異性M2型丙酮酸激酶并抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖[D];浙江大學(xué);2010年

8 李倩;以CotX為分子載體表面展示W(wǎng)SSV囊膜蛋白Vp19和Vp28的枯草芽孢桿菌重組芽孢的研究[D];江蘇大學(xué);2010年

9 唐莎;溶酶體膜蛋白-2抗體促發(fā)中性粒細(xì)胞胞外捕網(wǎng)形成在ANCA相關(guān)性血管炎中的分子機(jī)制[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2013年

10 畢瑩;長期高鹽攝入誘導(dǎo)自發(fā)性高血壓大鼠心肌自噬性空泡形成[D];天津醫(yī)科大學(xué);2013年

本文編號：2640482