發(fā)布時(shí)間：2020-04-24 10:32

【摘要】：背景 炎癥性腸病(inflammatory bowel disease ,IBD)主要包括潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)和克羅恩病(Crohn’s disease,CD)兩種類型。該疾病具有發(fā)病早,病程緩,易復(fù)發(fā)的特點(diǎn),往往需要長(zhǎng)期治療,費(fèi)用昂貴,嚴(yán)重影響生活質(zhì)量和工作效率。IBD發(fā)病機(jī)制至今仍然不明確,目前認(rèn)為IBD的發(fā)病是由遺傳因素、環(huán)境因素、腸道細(xì)菌和腸道免疫系統(tǒng)失調(diào)等多種因素相互作用所致,動(dòng)物和臨床實(shí)驗(yàn)均表明腸道菌群在IBD的發(fā)生發(fā)展中起重要作用,此外益生菌制劑治療IBD顯示出安全有效、無(wú)不良反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn),臨床應(yīng)用前景充滿希望。由于大多數(shù)的腸道細(xì)菌無(wú)法進(jìn)行體外培養(yǎng),本實(shí)驗(yàn)擬采用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Q-PCR)、指紋圖譜等分子生物學(xué)方法探討IBD患者糞便常見(jiàn)優(yōu)勢(shì)菌群的變化,并初步研究IBD患者腸道微生物的生物多樣性。 方法 收集2009年3月～2010年8月在我院確診的IBD病人(包括26例UC:活動(dòng)期/緩解期11/15,10例活動(dòng)期CD),分別利用UCAI及CDAI評(píng)價(jià)方法將UC和CD病例分為活動(dòng)期和緩解期。同時(shí)選取年齡性別相匹配的健康人(共14例)作為對(duì)照組,收集實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組新鮮大便標(biāo)本,提取糞便細(xì)菌基因組DNA,應(yīng)用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Q-PCR)定量分析糞便中擬桿菌屬、雙歧桿菌、纏繞桿菌屬、乳酸菌、腸球菌、脆弱桿菌屬和梭狀芽孢桿菌這些已知優(yōu)勢(shì)菌群的含量變化,將結(jié)果轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)og10CFU進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。同時(shí)應(yīng)用變性梯度凝膠電泳(DGGE)測(cè)定腸道菌群的生物多樣性,回收DGGE電泳條帶并測(cè)序比對(duì),初步分析實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的腸道菌群多樣性。 結(jié)果 優(yōu)勢(shì)菌群的定量檢測(cè)發(fā)現(xiàn),與正常對(duì)照組相比,腸道擬桿菌在活動(dòng)期UC(8.49 vs 7.03,P=0.014)和CD(8.49 vs 5.52,P=0.003)患者中明顯減少但在緩解期UC患者(8.49 vs 8.33,P0.05)沒(méi)有明顯變化;活動(dòng)期UC(7.97 vs 7.59,P=0.016)和CD(7.97 vs 7.51,P=0.001)患者腸道雙歧桿菌數(shù)量減少,而緩解期UC患者與健康對(duì)照(7.97 vs 7.93, P0.05)之間沒(méi)有明顯差異;活動(dòng)期UC(5.76 vs 5.24,P=0.001)、緩解期UC(5.76 vs 5.31,P=0.000)和CD(5.76 vs 5.18,P=0.000)患者腸道纏繞桿菌屬數(shù)量均降低;腸道乳酸桿菌數(shù)量在UC和CD患者有降低的趨勢(shì),但是與健康對(duì)照組相比并沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;緩解期UC腸道腸球菌也存在同樣的結(jié)果(4.76 vs 4.97,P=0.297),,但是在活動(dòng)期UC(4.76 vs 4.42,P=0.014)中是減少而活動(dòng)期CD患者(4.76 vs 5.84,P=0.003)腸道則是增多的;跟健康對(duì)照者相比,脆弱桿菌在活動(dòng)期UC(9.25 vs 6.84,P=0.000)和CD患者(9.25 vs 6.12,P=0.000)中均降低,在緩解期UC中(9.25 vs 8.22,P=0.000)也有這種現(xiàn)象,但不如活動(dòng)期疾病明顯;此外,緩解期UC(9.25 vs 8.22;P=0.000)、活動(dòng)期CD(9.25 vs 6.84;P=0.000)和活動(dòng)期CD(9.25 vs 6.74; P=0.000)梭狀芽孢桿菌數(shù)量均比健康對(duì)照減少。 DGGE結(jié)果顯示個(gè)體之間的細(xì)菌指紋圖譜存在較大差異,IBD患者的條帶與健康對(duì)照者明顯不同,主要由3～5條條帶構(gòu)成,總體而言,IBD患者尤其CD患者的腸道細(xì)菌多樣性是降低的。將所有IBD患者和健康對(duì)照者的條帶進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)504個(gè)Dice相似系數(shù)范圍從3.5%到88.9%,組間相似系數(shù)均低于組內(nèi)相似系數(shù),健康對(duì)照與活動(dòng)期UC、緩解期UC和活動(dòng)期CD相比分別為29.10±13.57%, 35.66±10.38%,25.47±20.50%。DGGE條帶測(cè)序的結(jié)果顯示這些細(xì)菌多數(shù)屬于不能培養(yǎng)的環(huán)境細(xì)菌,主要包括變形菌門、擬桿菌門和硬壁菌門,尤其硬壁菌門是疾病組和健康對(duì)照組的主要菌群。 結(jié)論 我們的結(jié)果表明在IBD患者中腸道菌群發(fā)生了明顯的變化,整體來(lái)說(shuō)是有害細(xì)菌增多而有益菌群減少;通過(guò)DGGE發(fā)現(xiàn),腸道細(xì)菌組成復(fù)雜、個(gè)體差異明顯,IBD患者腸道細(xì)菌生物多樣性降低,以CD更明顯,多數(shù)腸道細(xì)菌屬于不能培養(yǎng)的細(xì)菌,證明了腸道細(xì)菌的復(fù)雜性。
【圖文】：

第四軍醫(yī)大學(xué)107copies/μ l，分裝并作好3 結(jié)果3.1 糞便細(xì)菌基因組 DNA 提取結(jié)果三名健康對(duì)照者的糞便細(xì)菌基因完整，濃度高（見(jiàn)圖 1），適合用于下

3.1 糞便細(xì)菌基因組 DNA 提取結(jié)果三名健康對(duì)照者的糞便細(xì)菌基因組 DNA 提取結(jié)果表明，基因組 DNA 大小完整，濃度高（見(jiàn)圖 1），，適合用于下一步的實(shí)驗(yàn)。圖 1 三名健康對(duì)照者的糞便細(xì)菌基因組 DNA 瓊脂糖凝膠電泳圖。M：DNAMarker，HS：健康對(duì)照者3.2 PCR以三名健康對(duì)照者糞便細(xì)菌基因組 DNA 混合物為模板，利用 PCR 擴(kuò)增的上述細(xì)菌 16SrRNA 基因產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖示（見(jiàn)圖 2），產(chǎn)物片段單一，大小與預(yù)期相符，且未出現(xiàn)非特異擴(kuò)增。
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R574

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